病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)是由各种病毒感染引起的以心肌局灶性或弥漫性坏死为特征,伴随心肌间质的非特异性急、慢性炎症反应、纤维化或心脏扩张等临床表现的常见疾病。VMC好发于青壮年,其发病有逐年升高的趋势。绝大多数VMC可以自愈,但是15～25%VMC患者可演变为扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM),最终导致心力衰竭或恶性心律失常,其预后不良,病死率较高。Rose根据不同类型免疫细胞浸润将心肌炎分为淋巴细胞性心肌炎、巨细胞性心肌炎、嗜酸粒细胞性心肌炎和DCM等类型,同时国内外学者将VMC分为病毒复制期、免疫反应期和DCM期。因此,免疫损伤机制在VMC中起着重要的作用。既往研究认为,病毒感染机体后,急性期大量病毒在宿主心肌细胞中复制,直接导致心肌细胞的损伤、坏死及凋亡。而在急性期后若病毒未被机体清除,一方面病毒在心肌细胞中持续低水平复制,可以继续直接损伤心肌结构及功能；另一方面也可通过激活并维持免疫反应而导致心肌进一步损伤。因此本研究主要从VMC发生、发展及演变过程中可能存在的免疫机制为线索,探索细胞免疫在VMC发生、发展中的作用机制,为VMC的早期临床诊断及探寻免疫治疗的新靶点提供理论依据。在经典的辅助性CD4+T淋巴细胞亚群Th1/Th2的研究过程中,发现了一种新型的Th17细胞亚群,其分化发育和功能特征明显不同于之前发现的辅助性T淋巴细胞亚群Thl和Th2。Th17细胞的分化发育依赖于局部微环境及特定细胞因子的作用,其主要分泌的效应分子为IL-17A/F、IL-22和IL-21。最初的研究认为,VMC机体中CD4+T细胞向Thl分化增加,分泌IFN-γ以降低病毒的复制,从而减少心肌免疫细胞的浸润及炎症刺激,并导致心肌纤维化的程度减轻,保护心肌细胞避免过度免疫损伤并降低心肌纤维化的程度。此外,有研究表明心肌炎的病理损伤与Th2型细胞免疫反应密切相关。目前研究认为,Th17与机体抗病原体感染及一些自身免疫病密切相关,即Th17细胞可诱导机体局部组织的炎症反应的发生、放大和级联反应,继而加重其病理类型的发生与发展。近年来,Thl7细胞在自身免疫性心肌炎中的作用已成为心血管疾病研究的热点,在实验性自身免疫性心肌炎中的研究也取得了一定的进展。而VMC与实验性自身免疫性心肌炎在病理类型、临床表现、转归及预后上具有相同之处。那么,Th17细胞在机体受到病毒感染后的作用如何?当柯萨奇病毒感染后心肌局部炎症发生、发展及演变中的作用机制如何?同时Treg细胞亚群具有免疫抑制功能的CD4+T细胞亚群,在免疫炎症性疾病中具有保护作用。Treg口Th17均起源于CD4+T细胞亚群,在特定地局部免疫微环境作用下,二者可以相互转化、相互制衡。Th17/Treg细胞亚群失衡在多种自身免疫性疾病中受到了广泛地关注,那么,VMC与其它类型的自身免疫性疾病一样也存在Th17/Treg失衡现象?国内外学者尚缺乏深入地阐述和研究。在病毒性心肌炎向扩张型心肌病的演变过程中,心肌炎症是病毒感染导致心肌纤维化、心室重构和心力衰竭的共同通路,而心肌炎症反应主要依赖于不同类型的免疫细胞浸润,形成不同的局部免疫微环境。目前在不同T淋巴细胞亚群在VMC中的作用及其机制研究甚少,特别是Th17细胞在VMC细胞外基质的合成、分解和基质金属蛋白酶系统中作用的研究更少。因此,本研究通过探索Th17细胞在心肌组织局部微环境对心肌ECM的合成与分解和基质金属蛋白酶系统免疫调节中的作用机制,有利于寻找VMC的免疫诊断与治疗的新途径。柯萨奇B3病毒感染的小鼠在不同时期的心肌标本中有多种免疫细胞浸润,其中以大量巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞为主,伴随少量的B细胞、树突状细胞(dendritic cells, DC)和自然杀伤细胞。其中DC作为抗原提呈细胞,可以捕获提呈抗原,并逐渐演变为成熟的DC,在体内迁移,最终激活免疫反应。那么,DC在VMC的病因中的作用尚未清楚,但是DC从外周组织沿传入淋巴管迁移至邻近的次级淋巴组织后,与抗原特异性的初始T淋巴细胞聚集,诱导其活化并增殖,使其分化为效应性T细胞,从而启动机体的一系列免疫应答。随着新型免疫细胞亚群的发现及Th17/Treg调节机制的不断深入研究,DC在病毒性心脏病的发病机制也受到广泛地重视。因此,DC在VMC的发生、发展、演变及转归等方面的作用,特别是在病毒性心脏病中Th17/Treg细胞亚群分化的作用机制等方面,值得我们进一步研究与探索。本研究致力于探讨Th17细胞在急性病毒性心肌炎中的作用机制,特别是与其它细胞亚群的关系,如Treg细胞亚群；阐述Th17细胞在病毒性心肌炎向心肌纤维化演变过程中的作用机制,并探索DC在病毒性心脏病中Th17/Treg细胞亚群分化中的调节作用,以寻求临床上有效的免疫治疗靶点。全文共分为以下四部分：第一部分CVB3致小鼠病毒性心肌炎、扩张型心肌病模型的建立目的建立小鼠急、慢性心肌炎和扩张型心肌病动物模型。方法雄性Balb/c小鼠210只,体重12-16g,随机设立病毒感染后不同时间点,分别为0天组(n=35)、7天组(n=35)、10天组(n=35)、14天组(n=35)、2月组(n=35)和3月组(n=35)。每组随机抽取10只,腹腔注射不含病毒的Eagel’s培养液(EMEM),作为正常对照组(Control group)；其余小鼠腹腔均接种柯萨奇病毒B3(CVB3)建立小鼠急、慢性心肌炎和扩张型心肌病动物模型；分别于接种病毒后第0、7、10与14天及2月、3月末处死动物并收集外周血、血清、脾脏及心脏组织等标本；于感染后第7天、2月、3月末动物模型组与同期对照组小鼠分别进行心脏超声检查、病理学染色并计算心肌胶原容积积分。结果小鼠心肌在感染后第7天出现心肌纤维断裂、心肌细胞变性坏死、间质充满炎性细胞浸润,伴心肌纤维化增生,主要以局限在心肌坏死灶周边；计算心肌病理积分结果显示,在感染后第7天明显升高,第10天最高,第14天后开始下降。而CVB3复制水平在感染后第7天最高。至第2月末感染小鼠出现心肌纤维断裂,心肌内炎性细胞浸润,心肌间质纤维化增加,心腔扩大及心脏收缩及舒张功能均减退；第3月末小鼠心肌间质大量胶原异常增生呈弥漫性分布,心肌炎性细胞浸润减少,左室腔明显扩大,心脏舒张功能显著减退；同时心肌胶原容积积分明显升高。结论以CVB3单次和增量重复感染Balb/c小鼠成功建立了急、慢性病毒性心肌炎和扩张型心肌病动物模型。在急性病毒性心肌炎中,以感染后第7-10天心肌病理损伤最为明显,CVB3病毒复制水平在第7天最高。在慢性病毒性心肌炎及扩张型心肌病中,以感染后第2个月后心脏结构与功能显著减退,但心肌胶原容积积分以第3个月最为显著。第二部分Th17细胞在急性病毒性心肌炎中的作用机制及对Treg细胞的影响目的探讨Th17细胞/白介素-17在急性病毒性心肌炎中的作用机制及其对Treg细胞亚群的影响。方法首先采用流式细胞仪技术分别检测正常对照组、急性病毒性心肌炎组(0、7、10、14天)脾脏中Th17细胞的表达,同时使用Real-time PCR技术检测急性心肌炎心肌组织中CVB3病毒复制水平与IL-17、TGF-β表达并进行相关性分析。采用激光共聚焦显微镜及酶联免疫吸附试验方法分别观察Th17、Treg细胞在心肌组织及外周血清中IL-17、TGF-β的表达水平。分别对各组小鼠心肌组织进行HE染色计算心肌损伤的病理积分,使用Real-time PCR检测病毒复制水平。再将Balb/c小鼠70只,随机分为对照组(Control)(n=10)、急性心肌炎组(AVMC)(n=20)、Isotype组(n=20)及Anti-IL-17组(n=20)。Control组小鼠腹腔注射等量EMEM;而AVMC、Isotype及Anti-IL-17A组小鼠均腹腔接种CVB3；然后Isotype及Anti-IL-17组小鼠于病毒感染后隔日分别腹腔注射IgG(100μg)、IL-17Ab (100μg)。所有小鼠均于病毒感染第7天后处死并取心脏组织、血清及脾脏组织；采用流式细胞仪测定CD4+, CD8+, CD4+/CD8+T淋巴细胞数量,并检测CD4+Perforin+T淋巴细胞,CD8+Perforin+T淋巴细胞,CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞的表达量。使用Real-time PCR检测心肌组织中IL-17A及CVB3病毒复制水平,并使用H&E染色计算心肌病理积分观察各组心肌损伤的程度,最后采用Western blot法检测心肌组织中IFN-γ、TGF-β1及VP1等蛋白表达水平,Cytomix方法检测血清中T细胞亚群相关细胞因子的表达谱。结果急性病毒性心肌炎感染后第7、10及14天脾脏中Th17细胞数较正常对照组明显增加,其中以第10天增加最为明显,Real-time PCR实验结果显示心肌组织中IL-17A mRNA及CVB3RNA水平表达均升高,二者呈显著正相关关系。而心肌组织中TGF-β mRNA在心肌中的表达也呈明显升高趋势,但是与CVB3RNA水平呈显著负相关关系；结合Western-blot及Cytomix方法检测心肌组织及血清中Th17相关细胞因子IL-17A,IL-6,IL-21,IL-10,IFN-γ,和IL-2的表达水平,与正常对照组相比,这些细胞因子的表达均明显升高。在急性病毒性心肌炎模型中,心肌组织H＆E染色计算病理积分结果显示,感染后第10天心肌损伤最重,而CVB3病毒复制在第7天最明显。采用IL-17A中和抗体干预后,结果显示IL-17A能够改善急性病毒性心肌炎心肌病理损伤程度,并能够降低心肌CVB3病毒复制水平；结合流式细胞技术及Western blot检测结果显示,IL-17A中和抗体干预能够显著降低Treg细胞、提高体内CD8+T细胞的数量及穿孔素的表达水平,使Treg细胞导致杀伤性T细胞的抑制功能恢复；同时上调心肌组织中IFN-γ的表达。从血清学的检测结果也显示,IL-17A中和抗体干预使体内Th17细胞相关的细胞因子IL-6、IL-17A及IL-22的表达明显下降,而IFN-γ的表达却明显升高。结论急性病毒性心肌炎模型中小鼠脾脏Th17细胞及心肌中IL-17A表达与正常对照组比较明显增加。同时在急性心肌炎心肌组织中IL-17A mRNA的水平与CVB3病毒复制水平升高,二者呈正相关关系；而TGF-β mRNA在心肌中的表达也呈上升趋势,但是与CVB3复制水平呈负相关关系。其中在感染后第10天Th17细胞表达最多,而CVB3病毒复制水平在第7天最高。IL-17A中和抗体明显改善急性病毒性心肌炎的病毒复制水平及心肌病理损伤程度,这一过程的作用机制可能是通过IL-17中和抗体减轻Treg细胞过度抑制杀伤性T细胞效应及促进IFN-γ的表达增加有关。第三部分：Thl7细胞/IL-17在心肌炎向心肌纤维化演变中的作用及机制研究目的研究阻断IL-17R干预IL-17后,对急性心肌炎后向心肌纤维化演变过程中的作用及机制研究。方法体内试验：将Balb/c小鼠50只,随机分为3组,即慢性病毒性心肌炎组(n=10),慢性病毒性心肌炎+AdIL-17R:Fc组(n=20),慢性病毒性心肌炎+Ad:null组(n=20)。慢性病毒性心肌炎+AdIL-17R:Fc组及慢性病毒性心肌炎+Ad:null组给予腹腔接种CVB3后,分别给予Ad:IL-17R:Fc及等量Ad:Fc;观察各组小鼠死亡率,并在3个月末进行心超检查后处死小鼠,采用天狼猩红染色及免疫组织化学方法检测心肌内胶原含量并运用图像分析软件计算CVF和Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量；使用ELISA方法测定血清中IL-6及TNF-α的含量,采用Western blot检测小鼠心肌组织中TGF-β1、IL-17A、ADAMTS-1及MMP-2/TIMP-1的表达水平,同时采用Real-time PCR方法检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达水平。体外试验：使用不同浓度IL-17A细胞因子作用于体外培养的心肌成纤维细胞,了解其对细胞增殖及心脏细胞外基质中重要的金属蛋白酶ADAMTS-1及MMPs/TIMPs表达的影响,同时测定心肌成纤维细胞中Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA水平变化,最后使用Real-time PCR方法观察IL-17A对心肌成纤维细胞中ADAMTS-1的作用是否通过ERK、p38、JNKMAPK的磷酸化修饰来实现的。结果使用流式细胞仪方法检测病毒感染后第2月、3月不同时间段Th17细胞的表达量。结果发现：与对照组比较,Th17细胞在第2月上升最为明显；采用AdIL-17R:Fc干预后,我们发现明显提高了小鼠的生存率(44%VS20%,p<0.05)；降低慢性心肌炎小鼠血清中IL-6和TNF-α细胞因子的水平；同时降低小鼠心肌组织中IL-17A的表达,而对IL-17RA的表达无明显影响。通过流式细胞仪技术检测外周Th17细胞,结果发现AdIL-17R:Fc(?)够降低外周脾脏中Thl7细胞(7.88±1.01%VS10.3±1.67%,p<0.05)的表达。从心脏功能及形态学结果上发现,AdIL-17R：Fc能够改善心功能并减轻心脏过度扩大,明显降低心脏/体重比值。从心肌组织病理学检测结果表明：AdIL-17R：Fc显著降低心肌组织中CVF(4.27VS8.7,p<0.05)及Ⅰ型、Ⅲ型胶原在心肌组织中的沉积。经过蛋白印迹定量检测结果发现：AdIL-17R:Fc(?)抑制心肌ADAMTS-1和MMP-2蛋白的表达,而对TIMP-1的表达无明显影响；体外实验研究结果显示：IL-17A细胞因子能促进ADAMTS-1、MMP-2及TIMP-1的蛋白表达,并刺激心肌成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达增加；同时促进心肌成纤维细胞的增殖。进一步通过体外实验进一步探索IL-17A对心肌成纤维细胞ADAMTS-1作用的信号转导途径,结果显示：IL-17A通过p38及ERK磷酸化途径影响ADAMTS-1mRNA水平的表达；而不是通过JNK的磷酸化途径来实现的。结论在慢性病毒性心肌炎及扩张型心肌病中,脾脏Th17细胞及心肌中IL-17A表达与正常对照组比较明显增加,而在感染后第2月Th17细胞数量较同期对照组明显上升,而感染后第3月有所下降。同时第2-3月心肌损伤及纤维化程度较同期对照组明显增加,并且在感染后第3月的增加更为明显。AdIL-17R:Fc干预后结果显示：AdIL-17R：Fc能降低扩张型心肌病小鼠死亡率及减轻心肌纤维化的机制,可能与其抑制Th17细胞及其分泌的IL-17A细胞因子后产生免疫调节作用有关。同时AdIL-17R：Fc使心肌组织中ADAMTS-1、MMP-2/TIMP-1表达明显下降,减轻其对心肌细胞外基质的降解作用,从而减少心肌细胞外基质的破坏及降低心肌纤维化。另外在体外实验也证明,IL-17A在心肌成纤维细胞中对ADAMTS-1作用的信号转导通路与p38及ERK MAPK磷酸化密切相关,验证了体内实验中AdIL-17R:Fc可能导致IL-17A的产生,进一步降低细胞外基质的破坏,从而产生抗纤维化的保护作用。第四部分DC在急性病毒性心肌炎中的作用机制及其对T细胞分化为Th17、Treg细胞亚群的影响目的探讨DC在急性病毒性心肌炎中的作用机制及其对T细胞向Th17、Treg细胞亚群分化的影响。方法通过采集正常对照组(n=15)、急性病毒性心肌炎组(n=15)小鼠骨髓来源的DC进行原代培养,并对成熟的DC进行影像学及流式细胞仪鉴定DC表面分子标记物的表达。提取正常对照组小鼠外周脾脏组织CD4+T细胞,并使用磁珠分选后CD4+T细胞,重悬于RPMI-1640培养液,待与DC细胞共培养使用。然后采集正常对照组及急性病毒性心肌炎组小鼠骨髓来源的DC,并使用磁珠分选两组来源的DC后,与分选后CD4+T细胞共培养,并将不同组T淋巴细胞进行体外定向Th17及Treg细胞亚群分化。采用流式细胞技术及ELISA方法检测Th17、Treg田胞的数量及上清夜中IL-17A和TGF-p的含量,并使用细胞增殖实验(CCK-8)了解负载病毒抗原DC对CD4+T细胞增殖的影响。结果首先在小鼠骨髓来源的DC原代培养后观察,DC早期呈现贴壁生长方式,第2-3天后呈现多处集落生长,并且可见出芽状的突起,5-7天后集落渐渐减少,突起变长,呈悬浮生长方式,即从未成熟状态转化为成熟状态的DC。采用流式细胞技术对急性病毒性心肌炎骨髓来源的DC表面分子标志物检测,结果显示CD40、CD80和MHC-Ⅱ的表达比正常对照组明显增加,而CD86表面分子在二者之间未见显著性差异。在小鼠外周脾脏组织提取CD4+T细胞,使用磁珠分选的后CD4+T、DC细胞的纯度分别达到92%和95%,然后将来源于不同组别提取的DC向Th17和Treg细胞定向分化培养,结果显示：负载病毒抗原的DC能够刺激CD4+T淋巴细胞的增殖增加；同时促进CD4+T细胞向Th17细胞亚群分化增加,与对照组相比,有显著统计学意义；而二者在向Treg细胞亚群分化中,无显著统计学意义。结论急性病毒性心肌炎模型中骨髓来源的DC的成熟度与正常对照组比较明显增加。同时采用体外共培养及定向分化实验,结果表明：柯萨奇病毒感染机体后,能促进CD4+T细胞的增殖,并且促使初始T淋巴细胞向Th17细胞分化增加,而向Treg细胞亚群分化不明显。因此,在急性病毒性心肌炎模型中,Thl7细胞亚群的增加可能与负载病毒抗原DC的递呈作用有关,而这种作用可能是促使CD4+T细胞向Thl7分化增加的原因之所在。