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大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)原产于我国,是我国最重要的蔬菜作物之一。但是五十年代以来,由于病毒病的普遍流行,大白菜的生产遭受了巨大损失,病毒病成为大白菜的三大病害之一。研究表明,TuMV是大白菜病毒病的主要病原,占病毒分离物的71.9%。因此抗TuMV病毒病已成为我国目前大白菜抗病育种的主要目标,用传统的田间抗性接种鉴定法筛选抗性植株程序繁琐,费时费力,且准确度不高,难以适应生产的需要。因此寻找与抗性基因紧密连锁的分子标记,进行分子标记辅助育种,将会大大加快白菜抗病育种的进程。
本研究选用两个抗病材料(国家级抗源“8407”和高抗TuMV的高代自交系材料“73”)和两个感病材料(高感TuMV的自交系材料“71-36-2”和感病的大白菜核心种质材料“冠291”)为引物初筛模板。利用“71-36-2”和“73”杂交后自交所形成的F2代分离群体为试材进行遗传分析和测算标记连锁距离。对166个F2代单株人工接种TuMV-C4后,用生物学观察和酶联免疫检测相结合的方法对植株进行TuMV抗性鉴定。采用EST-SSR分子标记技术筛选与大白菜抗TuMV基因相连锁的分子标记,主要结果如下:
1.经过抗病性鉴定,在F2代分离群体中抗病单株和感病单株的比例为1∶3.15,x2测验表明,抗感分离比例符合1∶3的分离比例,表明在该群体中对TuMV-C4的抗性受隐性单基因控制。
2.通过L16(44)正交设计实验,优化了适合大白菜EST-SSR反应的最佳PCR反应体系,结果表明:各因素不同水平浓度对扩增结果均有一定影响,其中,以引物浓度影响最大,其次是dNTP和Taq DNA聚合酶,模板DNA浓度的影响最小。优化后的最佳体系(20μL)为:引物浓度1.0μmol·L-1,dNTPs0.25 mmol·L-1,Taq酶0.5U,模板DNA70ng。
3.从公共数据库搜索大白菜EST序列2566条,利用SSRIT软件筛选SSR,共筛选出313条SSR-ESTs,含SSR365个。根据SSR两翼的序列,利用Primer5.0软件设计引物135对,用于EST-SSR分子标记筛选。
4.利用上述引物,筛选与大白菜TuMV抗性基因紧密连锁的标记。结果表明,利用引物HCC259扩增出一条与抗TuMV基因连锁距离只有3.8cM且呈共显性的标记条带,这是目前首个与大白菜TuMV抗性位点连锁距离在5.0以下且呈共显性的分子标记,较以往的标记更有应用价值。
5.标记的适用性研究结果表明,该抗病标记可用于以73材料及其转育材料为亲本构建群体的TuMV抗性筛选;部分材料能否应用还需要进一步验证,有些抗感病材料尚需筛选其它的标记。