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研究目的:观察免疫荧光方法中不同固定剂对SGC7901细胞中RhoA蛋白化学定位的影响,找出最适合观察RhoA定位的固定方法。将cAMP及LPA分别及联合作用于SGC7901胃癌细胞株,通过检测靶基因PTEN在mRNA和蛋白水平的表达及活性的变化,来阐明cAMP-PKA通路与LPA-RhoA通路间的信号串扰对PTEN基因表达和PTEN活性的影响。研究方法:(1)细胞培养。(2)使用不同的固定剂(2%多聚甲醛,4%甲醛,甲醇,丙酮,10%三氯醋酸)进行固定,在荧光倒置显微镜下观察RhoA定位。(3)将细胞接种于六孔板上,用LPA和cAMP分别和联合作用,提取RNA,逆转录,采用定量PCR检测PTEN基因在mRNA水平的表达。(4)接种于六孔板上,作用条件为LPA和cAMP分别和联合作用,采用提取总蛋白的方法提取蛋白,用Western blotting检测PTEN基因在蛋白水平的表达。(5)将细胞接种于六孔板上,一孔做对照,另外几孔选取15’、30’、45’、60’几个不同作用时间点用LPA作用,再选一孔用cAMP预先作用半小时再加LPA作用半小时,采用提取磷酸化蛋白的方法提取蛋白,用Western blotting检测PTEN作用的底物Akt磷酸化水平的改变。研究结果:(1)2%多聚甲醛固定,不用0.3%TritonX-100时,染色显示胞质内可见少量RhoA蛋白散在分布,核内则有RhoA蛋白浓聚;用0.3%TritonX-100后,胞质内只能见极少量阳性染色,核内蛋白染色变得清晰。甲醛固定后染色显示RhoA蛋白主要在核内分布,使用TritonX-100后染色更为清楚。甲醇和丙酮固定后染色显示RhoA蛋白主要在胞质内分布,核内基本未见阳性分布,加TritonX-100后核内染色增强,胞质染色减弱。另外,使用10%三氯醋酸固定未加TritonX-100时染色较淡,胞质胞核都可见,加TritonX-100后核内可见蛋白浓聚,胞质染色减少。(2)LPA作用对PTEN基因在mRNA水平的表达没有影响,cAMP作用后PTEN基因表达有所降低,cAMP和LPA联合作用后也使PTEN的mRNA表达略有降低。(3)LPA作用和cAMP作用对PTEN基因在蛋白水平的表达没有影响。(4)LPA单独作用能使Akt的磷酸化水平升高,用RhoA依赖性蛋白激酶抑制剂Y-27632预作用后可部分抑制Akt磷酸化水平的升高;cAMP预作用可以完全抑制LPA刺激所致的Akt的磷酸化水平升高。结论:(1)免疫荧光法观察RhoA定位时,固定剂的不同及是否加TritonX-100对观察RhoA蛋白细胞内定位具有较大影响。用2%多聚甲醛固定可以较好的观察RhoA蛋白在细胞内的化学定位。(2)LPA不能使PTEN在mRNA和蛋白水平的表达发生变化,cAMP可以使PTEN在mRNA水平表达略有降低,但对其蛋白表达没有影响。(3)LPA可以使PTEN的底物Akt的磷酸化水平升高,用Y-27632阻断RhoA-ROCK信号转导通路,可以抑制LPA的作用,表明活化的RhoA通过使PTEN活性降低而使Akt磷酸化水平增加。cAMP作用可以完全阻断LPA引起的Akt磷酸化水平升高,表明cAMP-PKA介导的信号通路对RhoA介导的PTEN活性的降低有逆转作用。