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研究背景：糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)发病率逐年升高,已成为终末期肾脏疾病的重要病因。DN主要表现为肾小球硬化和肾间质纤维化。DN发病机制错综复杂。糖代谢紊乱和血流动力学改变是肾脏疾病的基础,众多的生长因子和细胞因子被激活直接参与DN的形成。近年来,作为RAAS系统的重要成员,醛固酮在肾脏疾病中的作用越来越受到学者的重视。醛固酮参与5/6残余肾模型、自发性高血压、梗阻性肾病、糖尿病肾病等多种肾脏疾病的发生发展。醛固酮与盐皮质激素受体结合后能调控多种靶基因的转录,导致水钠潴留,诱导氧化应激,促进炎症反应,上调多种促纤维化因子表达,促进糖尿病肾病的进展。近来研究证实,醛固酮通过影响组蛋白甲基化酶Dot1调控ENaCa基因的表达。Dot1是一种无SET结构域的组蛋白赖氨酸甲基转移酶,它能通过催化H3K79甲基化来建立和维持染色质的沉默,参与多种疾病的发生。Zhang等研究发现Dot1与转录因子AF9结合形成复合物结合在ENaC启动子区域,调控ENaCa的表达；醛固酮能下调Dot1与AF9表达,从而上调ENaC基因表达。醛固酮通过Dot1/AF9介导对ENaC基因表达的调控。这种机制可能存在于醛固酮调控的其他基因。有研究表明,内皮素(ET-1)系醛固酮所转录调节的靶基因之一。ET-1是目前发现的体内最强的血管收缩生物活性物质,具有收缩肾血管,减少血流量,增加胰岛素抵抗,趋化炎性细胞,促进细胞外基质合成等生物学效应,在DN发生发展中起到重要作用。醛固酮是否通过Dot1/AF9上调ET-1基因表达,促进糖尿病肾病的发生发展,查阅近10年公开发表的文献,尚未发现相关的研究报道。目的：观察高糖环境下醛固酮对ET-1表达的影响,探讨Dot1/AF9在醛固酮调控ET-1表达中的作用,研究醛固酮在糖尿病肾病模型鼠中对Dot1、AF9、ET-1的影响及安体舒通干预作用。方法：1.分别采用低糖(含葡萄糖1000mg/L)、高糖(含葡萄糖4500mg/L)、含不同浓度醛固酮(10nM,25nM,50nM, 100nM)的高糖DMEM培养大鼠肾小管上皮细胞(normal rat kidney cells, NRK-52E),采用RT-PCR、Western免疫印迹、免疫荧光检测等方法分别检测各组Dot1、AF9和ET-1的mRNA和蛋白质表达变化情况；2.分别采用低糖、高糖、含醛固酮(50nM)和安体舒通(100nM)的高糖DMEM干预NRK-52E,采用RT-PCR、Western免疫印迹、免疫荧光检测等方法分别检测各组Dot1、AF9和ET-1的mRNA和蛋白质表达变化情况；3.建立稳定转染Dot1/AF9质粒的细胞株,采用低糖、高糖和含醛固酮(50nM)的DMEM干预未转染和稳定转染Dot1/AF9质粒的NRK-52E,采用RT-PCR Western免疫印迹、免疫荧光检测等方法分别检测各组Dot1、AF9和ET-1mRNA和蛋白质表达变化情况；4.采用STZ诱导建立DN大鼠模型,分为正常组(N组)、糖尿病肾病组(DN组)、安体舒通干预组(SP组,给予安体舒通40mg/(kg*d)干预DN大鼠)三组,检测大鼠尿蛋白,血肌酐,血清和肾组织中醛固酮水平等,采用RT-PCR、免疫组化、Western免疫印迹等方法检测Dot1、AF9和ET-1mRNA和蛋白质表达情况。结果：1.高糖环境下,肾小管上皮细胞Dot1和AF9 mRNA和蛋白质表达降低,而ET-1 mRNA和蛋白质呈高表达。醛固酮刺激后,肾小管上皮细胞Dot1和AF9 mRNA和蛋白质仍呈低表达,而ET-1 mRNA和蛋白质出现明显高表达。2.安体舒通干预实验后,高糖环境下肾小管上皮细胞Dot1和AF9mRNA和蛋白质均表达上调,而ET-1mRNA和蛋白表达下调。3.高糖环境下稳定转染Dotl/AF9质粒的NRK-52E细胞用醛固酮刺激后,其Dot1/AF9表达呈高水平,ET-1蛋白质明显低于未转染Dot1/AF9质粒和转染空白质粒的NRK-52E细胞中ET-1的蛋白质表达。4.DN大鼠血糖、血压升高,尿蛋白排泄增加,血肌酐升高,肾脏病理呈糖尿病早期病理改变。与N组比较,虽然DN大鼠血清醛固酮水平无明显改变,但肾组织局部醛固酮含量明显升高。5.DN大鼠肾组织局部醛固酮含量明显升高的同时,Dot1mRNA和AF9mRNA和蛋白表达的下调,而肾组织ET-1 mRNA和蛋白表达明显升高。6.采用安体舒通干预DN大鼠,与DN组比较,SP组大鼠血压、血糖等无明显变化,但尿蛋白减少,血肌酐降低,肾脏病理改变减轻,肾组织Dot1和AF9mRNA和蛋白表达的上调,而ET-1 mRNA和蛋白表达下调。结论：1.高糖环境下醛固酮刺激肾小管上皮细胞后,Dot1和AF9呈低表达,而ET-1出现高表达。安体舒通干预实验和Dot1和AF9质粒转染后,肾小管上皮细胞Dot1和AF9表达上调,而ET-1表达下调,证实醛固酮通过影响Dot1和AF9表达进而调控肾小管上皮细胞ET-1基因转录。2.DN模型鼠出现肾间质损伤的同时,肾脏组织局部醛固酮水平升高,肾组织中Dot1和AF9低表达,而ET-1出现高表达,提示肾脏局部组织中高醛固酮水平可能参与了DN发病过程,且可能与醛固酮影响Dot1和AF9表达调控肾小管上皮细胞ET-1基因转录有关。3.安体舒通干预实验后,糖尿病肾病肾间质损伤减轻的同时,肾组织中Dot1和AF9表达上调,而ET-1基因表达下调,证明安体舒通对糖尿病肾病的肾脏保护作用可通过阻断醛固酮,影响Dot1和AF9水平而调控肾小管上皮细胞ET-1表达而实现。通过本研究我们获得的结论是：醛固酮可影响肾小管上皮细胞DOT1/AF9表达,进而调控肾小管上皮细胞ET1基因转录而在糖尿病肾病发病机制中发挥着十分重要的作用。