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β-胡萝卜素是天然的着色剂和营养增强剂,在食品行业受到广泛应用。目前,通过代谢工程菌株有望提高β-胡萝卜素的产量,从而替代天然提取或化学合成方法。由于β-胡萝卜素的生物合成涉及多个基因,构建高效合成代谢途径成为获得高产β-胡萝卜素工程菌株的关键。本论文利用合成生物学和代谢工程手段构建产β-胡萝卜素大肠杆菌工程菌株,并联合理性改造、随机诱变和发酵优化技术建立了提高β-胡萝卜素产量的可行策略。主要研究内容及结果如下:1.β-胡萝卜素合成代谢途径组装及工程菌株构建。首先,分析运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)ZM4菌株的启动子元件活性,筛选出代表性的启动子和终止子元件分别构建元件库。其次,利用Golden Gate技术将来自成团泛菌(Pantoea agglomerans)CGMCC 1.2244的β-胡萝卜素合成基因簇与元件库进行随机组装并获得43株工程菌,其中Crt1-29的β-胡萝卜素产量最高为0.68 mg/g细胞干重(DCW)。2.理性设计优化β-胡萝卜素合成代谢。为进一步优化β-胡萝卜素生物合成途径,将β-胡萝卜素合成基因簇分为crtE、crtXYI和crtB三部分,分别与上述元件库组装成转录单元后再组装完整的代谢途径,最终获得46株工程菌,其中Crt2-20的β-胡萝卜素产量最高为0.83 mg/g DCW,相比Crt1-29提高了21.5%,这证明分别优化转录单元是提高生物合成的有效策略。此外,随机挑选出若干菌株对其β-胡萝卜素合成途径中组装的基因元件进行测序,各表达元件的使用频率和活性分析结果初步证实了优化启动子和终止子可以提高β-胡萝卜素产量。3.常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变及筛选。为进一步提高β-胡萝卜素产量,利用ARTP对代谢工程菌株进行诱变处理,共筛选出65个突变株,产量有显著提升,较诱变之前分别提高了3-9%。4.产β-胡萝卜素工程菌株发酵过程优化。对发酵参数包括培养基种类、碳源、氮源和溶氧进行单因素实验,最终确定发酵培养基为2YT+1%蔗糖,发酵温度为37℃,发酵溶氧为30%。在此发酵条件下将突变株进行摇瓶发酵,突变株中A7和B8产量相比对照提升最高。接着将这两株菌进行发酵体积为3 L的批次发酵,结果显示,B8产量达到1.50 mg/g DCW,相比Crt2-22进一步提高了19.2%。综上所述,本研究采用代谢工程理性构建—ARTP随机诱变—发酵优化的策略,可有效提高β-胡萝卜素生物合成产量。