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开口箭(Tupistra chinensis Baker.)为百合科(Liliaceae)开口箭属植物，其根茎药用，称为竹根七，是陕西秦岭特色中药“太白七药”家族中的重要一员。竹根七自古多为民间用药，具有清热泻火、行气止痛、祛风除湿、活血散瘀等功效。近年来，从开口箭属植物中分离得到多种生物活性成分，包括黄酮类、多糖类和甾体皂苷类等。研究表明这些成分具有抗肿瘤、抗炎、抑菌、醒酒、增强免疫功能等多种药理作用，其中甾体皂苷类化合物的抗肿瘤活性得到广泛关注。但是，对该属植物药理活性的研究尚主要停留在总提取物或总皂苷层面，单体化合物研究相对较少，致使药理作用及作用机制还未完全阐明。此外，尽管已从开口箭中鉴定了85个甾体皂苷类成分，但根据我们对采自陕西秦岭的药材预实验结果显示，尚有大量新的甾体皂苷成分未获分离，预示着其化学多样性尚待进一步阐明。因此，本课题选取开口箭为研究对象，通过现代色谱和波谱技术，分离鉴定其单体成分，并对所获成分进行抑制肿瘤细胞增殖活性筛选，初步探讨相应构效关系，以进一步丰富开口箭化学成分数据库，为开口箭的开发利用提供研究资料。
本研究选取采自秦岭牛背梁地区的开口箭干燥根茎7.5kg，70%乙醇提取、石油醚脱脂后用水饱和正丁醇萃取，采用多种色谱分离技术，从正丁醇萃取物中分离到29个单体化合物，并运用波谱技术结合化学手段鉴定了其中20个化合物的结构，包括15个呋甾烷醇类皂苷、2个螺甾烷醇类化合物和3个苯丙素苷类化合物。它们的结构分别为：(23R,25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,23β,26-四羟基-呋甾-5,20(22)-二烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-1)，(23S,25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,23α,26-四羟基-呋甾-5,20(22)-二烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-2)，(23R,25R)-1β,2β,3β,4β,5β,23β,26-七羟基-呋甾-20(22)-烯-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-3)，(23R,25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,5β,23β,26-五羟基-呋甾-20(22)-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-4)，(23S,25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,5β,23α,26-五羟基-呋甾-20(22)-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-5)，(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,20α,26-四羟基-5β-呋甾-22-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D–吡喃葡萄糖苷(Z-6)，(23S,25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,26-三羟基-23α-正丁氧基-5β-呋甾-20(22)-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-7)，(23R,25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,26-三羟基-23β-正丁氧基-5β-呋甾-20(22)-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-8)，(23S,25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,26-三羟基-23α-正丁氧基-5β-呋甾-20(22)-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-9 )，(23R, 25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,26-三羟基-23β-正丁氧基-5β-呋甾-20(22)-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-10)，1β,2β,3β,4β,5β,7α,26-七羟基-呋甾-20(22),25(27)-二烯-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-11)，26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,2β,3β,4β,5β,26-六羟基-呋甾-20(22),25(27)-二烯-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-12)，1β,2β,3β,4β,5β,7α,26-七羟基-22α-甲氧基-呋甾-25(27)-双键-6-酮-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-13)，1β,2β,3β,4β,5β,7α,22α,26-八羟基-呋甾-25(27)-双键-6-酮-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-14 )，(25S)-5β-螺甾-1β,2β,3β,4β,5,6β-六醇(Z-15 )，(25R)-5β-螺甾-1β,2β,3β,4β,5,6β-六醇(Z-16)，1β,3β-二羟基孕甾-20-双键-20-羧酸γ-内酯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-17)，对烯丙基苯酚β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-18)，去甲丁香酚β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-19)和1,2-二-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-烯丙基苯酚(Z-20)。其中，化合物Z-1~Z-10以及Z-17为11个新化合物；苯丙素苷类化合物是首次在开口箭属植物中发现，并且Z-18~Z-20也是首次从百合科植物中分离得到；螺甾烷醇Z-15和Z-16则是首次从开口箭属植物中获得。
通过CCK-8法对11个新的呋甾皂苷进行了抑制肿瘤细胞U87、SHG44、U251、LN229和HepG2增殖的活性筛选，结果发现其中8个化合物对肿瘤细胞具有一定程度的抑制作用，其中化合物Z-1和Z-4抑制作用显著，对各细胞株的IC50值分别为3.58±0.98μM和13.85±2.49μM(U251)、24.12±1.22μM和32.04±3.78μM(LN229)、11.13±1.08μM和25.36±1.76μM(HepG2)。初步构效关系分析认为：实验所研究的呋甾皂苷中A环羟基取代较多者一般无抑制肿瘤细胞增殖作用，而取代较少者则具有抑制作用的可能；这些化合物对肿瘤细胞抑制作用的特异性较强，具有细胞系敏感性差异和化合物选择性差异；具有1β-OH、△5(6)((或5β-OH)结构的化合物，其C-23的绝对构型对其抑制肿瘤细胞增殖作用具有重要影响，值得进一步研究；根据文献报道，甾体皂苷抗肿瘤一般为多靶点、多通路，尚鲜有发现直接结合的靶点，而本研究的结果显示差向异构体Z-1和Z-2以及Z-4和Z-5仅因C-23绝对构型不同即表现出显著活性差异，预示此类化合物很可能存在具体结合的药物靶点。
课题创新性及研究意义
1.对开口箭根茎的化学成分进行了系统研究，分离得到29个单体化合物，鉴定了其中20个化合物的结构，11个确认为新化合物。在开口箭属植物中首次发现苯丙素苷类化合物，并首次分离得到2个螺甾烷醇。
2.实验中得到的9个在C-23位有取代基的新呋甾皂苷类化合物中，醇羟基取代的化合物在该属植物中较为少见，而正丁氧基取代的化合物，则为首次在该属植物的甾体皂苷成分中发现。
3.通过活性筛选发现了2个有显著抑制肿瘤细胞增殖作用的化合物。
4.本课题为“太白七药”竹根七的开发应用提供了实验依据，为开口箭甾体皂苷抗肿瘤研究提供了化合物样品和实验数据，为开口箭属植物的进一步研究提供了实验资料。
本研究选取采自秦岭牛背梁地区的开口箭干燥根茎7.5kg，70%乙醇提取、石油醚脱脂后用水饱和正丁醇萃取，采用多种色谱分离技术，从正丁醇萃取物中分离到29个单体化合物，并运用波谱技术结合化学手段鉴定了其中20个化合物的结构，包括15个呋甾烷醇类皂苷、2个螺甾烷醇类化合物和3个苯丙素苷类化合物。它们的结构分别为：(23R,25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,23β,26-四羟基-呋甾-5,20(22)-二烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-1)，(23S,25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,23α,26-四羟基-呋甾-5,20(22)-二烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-2)，(23R,25R)-1β,2β,3β,4β,5β,23β,26-七羟基-呋甾-20(22)-烯-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-3)，(23R,25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,5β,23β,26-五羟基-呋甾-20(22)-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-4)，(23S,25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,5β,23α,26-五羟基-呋甾-20(22)-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-5)，(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,20α,26-四羟基-5β-呋甾-22-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D–吡喃葡萄糖苷(Z-6)，(23S,25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,26-三羟基-23α-正丁氧基-5β-呋甾-20(22)-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-7)，(23R,25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,26-三羟基-23β-正丁氧基-5β-呋甾-20(22)-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-8)，(23S,25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,26-三羟基-23α-正丁氧基-5β-呋甾-20(22)-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-9 )，(23R, 25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,3β,26-三羟基-23β-正丁氧基-5β-呋甾-20(22)-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-10)，1β,2β,3β,4β,5β,7α,26-七羟基-呋甾-20(22),25(27)-二烯-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-11)，26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1β,2β,3β,4β,5β,26-六羟基-呋甾-20(22),25(27)-二烯-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-12)，1β,2β,3β,4β,5β,7α,26-七羟基-22α-甲氧基-呋甾-25(27)-双键-6-酮-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-13)，1β,2β,3β,4β,5β,7α,22α,26-八羟基-呋甾-25(27)-双键-6-酮-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-14 )，(25S)-5β-螺甾-1β,2β,3β,4β,5,6β-六醇(Z-15 )，(25R)-5β-螺甾-1β,2β,3β,4β,5,6β-六醇(Z-16)，1β,3β-二羟基孕甾-20-双键-20-羧酸γ-内酯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-17)，对烯丙基苯酚β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-18)，去甲丁香酚β-D-吡喃葡萄糖苷(Z-19)和1,2-二-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-烯丙基苯酚(Z-20)。其中，化合物Z-1~Z-10以及Z-17为11个新化合物；苯丙素苷类化合物是首次在开口箭属植物中发现，并且Z-18~Z-20也是首次从百合科植物中分离得到；螺甾烷醇Z-15和Z-16则是首次从开口箭属植物中获得。
通过CCK-8法对11个新的呋甾皂苷进行了抑制肿瘤细胞U87、SHG44、U251、LN229和HepG2增殖的活性筛选，结果发现其中8个化合物对肿瘤细胞具有一定程度的抑制作用，其中化合物Z-1和Z-4抑制作用显著，对各细胞株的IC50值分别为3.58±0.98μM和13.85±2.49μM(U251)、24.12±1.22μM和32.04±3.78μM(LN229)、11.13±1.08μM和25.36±1.76μM(HepG2)。初步构效关系分析认为：实验所研究的呋甾皂苷中A环羟基取代较多者一般无抑制肿瘤细胞增殖作用，而取代较少者则具有抑制作用的可能；这些化合物对肿瘤细胞抑制作用的特异性较强，具有细胞系敏感性差异和化合物选择性差异；具有1β-OH、△5(6)((或5β-OH)结构的化合物，其C-23的绝对构型对其抑制肿瘤细胞增殖作用具有重要影响，值得进一步研究；根据文献报道，甾体皂苷抗肿瘤一般为多靶点、多通路，尚鲜有发现直接结合的靶点，而本研究的结果显示差向异构体Z-1和Z-2以及Z-4和Z-5仅因C-23绝对构型不同即表现出显著活性差异，预示此类化合物很可能存在具体结合的药物靶点。
课题创新性及研究意义
1.对开口箭根茎的化学成分进行了系统研究，分离得到29个单体化合物，鉴定了其中20个化合物的结构，11个确认为新化合物。在开口箭属植物中首次发现苯丙素苷类化合物，并首次分离得到2个螺甾烷醇。
2.实验中得到的9个在C-23位有取代基的新呋甾皂苷类化合物中，醇羟基取代的化合物在该属植物中较为少见，而正丁氧基取代的化合物，则为首次在该属植物的甾体皂苷成分中发现。
3.通过活性筛选发现了2个有显著抑制肿瘤细胞增殖作用的化合物。
4.本课题为“太白七药”竹根七的开发应用提供了实验依据，为开口箭甾体皂苷抗肿瘤研究提供了化合物样品和实验数据，为开口箭属植物的进一步研究提供了实验资料。