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目的
叶酸(folic acid，FA)是神经发育的重要维生素，通过一碳代谢途径参与DNA和RNA合成，以及DNA甲基化过程。本研究旨在揭示孕妇叶酸补充状况对1、3、24月龄婴幼儿神经发育的影响，探讨DNA甲基化作用机制，同时为我国育龄女性合理补充叶酸提供科学依据。
研究对象与方法
本研究为出生队列研究，于2015年7月至2018年12月在天津市1个区级妇幼保健中心和6个社区卫生服务中心进行，采用天津市妇幼卫生信息系统收集母亲孕检、生产和产后检查记录。在产后第一次检查时回顾性收集母亲孕期叶酸补充状况，对1、3、24月龄婴幼儿进行随访，采用《0~6岁儿童神经心理发育量表》对婴幼儿神经发育水平进行评估，测查发育商(development quotient， DQ)及五个神经行为能区(大运动、精细运动、适应性、语言、社交)得分。回顾性收集母亲孕期叶酸补充状况，按剂量剂型分为：未补充组(Non-users)、单纯叶酸营养素补充组(FA-400μg/d)、复合微量营养素(multiple micronutrient， MMN)叶酸400μg/d补充组(MMN(FA-400μg/d))、MMN叶酸800μg/d补充组(MMN(FA-800μg/d))；按补充持续时间分为：未补充组(Non-users)、孕早期即补充≤3个月组(Users≤3mo)、孕早中期即补充3~6个月组(Users 3-6 mo)、孕早中晚期即补充＞6个月组(Users＞6mo)。
于孕中期(妊娠16~18周)采集孕妇静脉血，检测孕中期DNA甲基化及一碳代谢物水平。采用全自动生化分析仪检测孕中期血清同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)；液相色谱法检测血浆S-腺苷同型半胱氨酸(s-adenosyl-homocysteine，SAH)和S-腺苷蛋氨(S-adenosyl-methionine，SAM)；ELISA法检测反映甲基化水平的5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)；采用MethylTarget技术测定叶酸代谢基因DNA甲基化水平。
采用混合线性模型探讨孕期叶酸补充状况、孕中期一碳代谢物及DNA甲基化水平与婴幼儿神经发育的关系。使用IBMSPSSAmos构建结构方程模型，即路径分析，探讨孕期影响因素与婴幼儿神经发育的关系。所有分析结果，假设检验水准为α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
分析孕期叶酸补充的影响因素，结果显示，Non-users组产妇低学历(高中/中专及以下)、低家庭月收入(＜5000元)、经产、生育早产儿(＜37周)的比例高于各补充组。叶酸补充剂量剂型对于婴幼儿神经发育的影响方面，以Non-users组为参照，FA-400μg/d补充组、MMN(FA-400μg/d)补充组和MMN(FA-800μg/d)补充组对婴幼儿1和24月龄DQ有促进作用(P＜0.05)；但各补充组之间DQ值差异无统计学意义(P＞0.05)。叶酸补充持续时间对于婴幼儿神经发育的影响，Users≤3mo、Users3-6mo和Users＞6mo组婴幼儿1和24月龄DQ值均高于Non-users组(P＜0.05)；但各补充持续时间组间DQ值差异无统计学意义(P＞0.05)。不同剂量剂型以及持续时间叶酸补充各组对3月龄婴儿DQ的影响，差异无统计学意义(P＞0.05)。
检测母亲一碳代谢相关指标血清Hcy、血浆SAH、SAM、SAM/SAH和反映DNA甲基化水平的5mC%，分析对1月龄婴儿神经发育的影响，结果显示，血浆SAM、SAM/SAH、5mC%对1月龄婴儿DQ有促进作用(P＜0.05)。血浆SAM/SAH对大运动有促进作用；血清Hcy对大运动有抑制作用(P＜0.05)。血浆SAM、SAM/SAH对精细运动有促进作用(P＜0.05)。路径分析显示孕期叶酸补充可升高血浆SAM/SAH水平，血浆SAM/SAH对1月龄婴儿DQ有促进作用(P＜0.05)。
特定基因甲基化方面，Non-users，Users≤3mo，Users＞6mo组孕中期亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)、蛋氨酸合酶还原酶(methionine synthase reductase，MTRR)、蛋氨酸合成酶(methionine synthase， MTR)基因层面的甲基化水平差异无统计学意义(P＞0.05)。部分基因片段甲基化单倍型频率以及不同CpG位点甲基化水平方面，三组间差异有统计学意义(P＜0.05)，这些差异可能与叶酸补充有关。
结论
孕期叶酸补充对婴幼儿1月龄及24月龄神经发育有促进作用，但不同剂量剂型及持续时间的叶酸补充对婴幼儿神经发育水平影响，差异无统计学意义。路径分析结果显示孕期补充叶酸通过升高血浆SAM/SAH值间接促进婴儿DQ。由于血浆SAM/SAH可反映机体甲基化潜力，因此本研究提示孕期叶酸补充可能通过DNA甲基化途径对婴幼儿神经发育产生影响。
叶酸(folic acid，FA)是神经发育的重要维生素，通过一碳代谢途径参与DNA和RNA合成，以及DNA甲基化过程。本研究旨在揭示孕妇叶酸补充状况对1、3、24月龄婴幼儿神经发育的影响，探讨DNA甲基化作用机制，同时为我国育龄女性合理补充叶酸提供科学依据。
研究对象与方法
本研究为出生队列研究，于2015年7月至2018年12月在天津市1个区级妇幼保健中心和6个社区卫生服务中心进行，采用天津市妇幼卫生信息系统收集母亲孕检、生产和产后检查记录。在产后第一次检查时回顾性收集母亲孕期叶酸补充状况，对1、3、24月龄婴幼儿进行随访，采用《0~6岁儿童神经心理发育量表》对婴幼儿神经发育水平进行评估，测查发育商(development quotient， DQ)及五个神经行为能区(大运动、精细运动、适应性、语言、社交)得分。回顾性收集母亲孕期叶酸补充状况，按剂量剂型分为：未补充组(Non-users)、单纯叶酸营养素补充组(FA-400μg/d)、复合微量营养素(multiple micronutrient， MMN)叶酸400μg/d补充组(MMN(FA-400μg/d))、MMN叶酸800μg/d补充组(MMN(FA-800μg/d))；按补充持续时间分为：未补充组(Non-users)、孕早期即补充≤3个月组(Users≤3mo)、孕早中期即补充3~6个月组(Users 3-6 mo)、孕早中晚期即补充＞6个月组(Users＞6mo)。
于孕中期(妊娠16~18周)采集孕妇静脉血，检测孕中期DNA甲基化及一碳代谢物水平。采用全自动生化分析仪检测孕中期血清同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)；液相色谱法检测血浆S-腺苷同型半胱氨酸(s-adenosyl-homocysteine，SAH)和S-腺苷蛋氨(S-adenosyl-methionine，SAM)；ELISA法检测反映甲基化水平的5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)；采用MethylTarget技术测定叶酸代谢基因DNA甲基化水平。
采用混合线性模型探讨孕期叶酸补充状况、孕中期一碳代谢物及DNA甲基化水平与婴幼儿神经发育的关系。使用IBMSPSSAmos构建结构方程模型，即路径分析，探讨孕期影响因素与婴幼儿神经发育的关系。所有分析结果，假设检验水准为α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
分析孕期叶酸补充的影响因素，结果显示，Non-users组产妇低学历(高中/中专及以下)、低家庭月收入(＜5000元)、经产、生育早产儿(＜37周)的比例高于各补充组。叶酸补充剂量剂型对于婴幼儿神经发育的影响方面，以Non-users组为参照，FA-400μg/d补充组、MMN(FA-400μg/d)补充组和MMN(FA-800μg/d)补充组对婴幼儿1和24月龄DQ有促进作用(P＜0.05)；但各补充组之间DQ值差异无统计学意义(P＞0.05)。叶酸补充持续时间对于婴幼儿神经发育的影响，Users≤3mo、Users3-6mo和Users＞6mo组婴幼儿1和24月龄DQ值均高于Non-users组(P＜0.05)；但各补充持续时间组间DQ值差异无统计学意义(P＞0.05)。不同剂量剂型以及持续时间叶酸补充各组对3月龄婴儿DQ的影响，差异无统计学意义(P＞0.05)。
检测母亲一碳代谢相关指标血清Hcy、血浆SAH、SAM、SAM/SAH和反映DNA甲基化水平的5mC%，分析对1月龄婴儿神经发育的影响，结果显示，血浆SAM、SAM/SAH、5mC%对1月龄婴儿DQ有促进作用(P＜0.05)。血浆SAM/SAH对大运动有促进作用；血清Hcy对大运动有抑制作用(P＜0.05)。血浆SAM、SAM/SAH对精细运动有促进作用(P＜0.05)。路径分析显示孕期叶酸补充可升高血浆SAM/SAH水平，血浆SAM/SAH对1月龄婴儿DQ有促进作用(P＜0.05)。
特定基因甲基化方面，Non-users，Users≤3mo，Users＞6mo组孕中期亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)、蛋氨酸合酶还原酶(methionine synthase reductase，MTRR)、蛋氨酸合成酶(methionine synthase， MTR)基因层面的甲基化水平差异无统计学意义(P＞0.05)。部分基因片段甲基化单倍型频率以及不同CpG位点甲基化水平方面，三组间差异有统计学意义(P＜0.05)，这些差异可能与叶酸补充有关。
结论
孕期叶酸补充对婴幼儿1月龄及24月龄神经发育有促进作用，但不同剂量剂型及持续时间的叶酸补充对婴幼儿神经发育水平影响，差异无统计学意义。路径分析结果显示孕期补充叶酸通过升高血浆SAM/SAH值间接促进婴儿DQ。由于血浆SAM/SAH可反映机体甲基化潜力，因此本研究提示孕期叶酸补充可能通过DNA甲基化途径对婴幼儿神经发育产生影响。