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目的:口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是口腔颌面部最常见恶性肿瘤之一,占全球恶性肿瘤的3%。据统计,我国每年口腔癌的新发病例约4.65万,发病年龄大多在40-60岁之间,男性相对女性较多。随着医疗水平的逐渐提高,以手术切除为主的综合序列治疗方法使口腔癌的预后有了明显改善,但患者的5年生存率仍停留在55%-60%。众所周知,OSCC的预后取决于临床分期,组织学分级,淋巴结转移等因素,但大多数患者就诊时已属晚期,因此口腔癌的早期诊断,早期治疗十分重要。研究者报道除基因变异、缺失等遗传因素外,DNA甲基化等表观遗传学的改变是肿瘤的发生的早期事件。临床应用表观遗传学标志物能够对口腔鳞癌做到早期诊断,对预后准确预测,进而改善患者的生存质量,提高患者的生存率。人源NKD基因家族包括NKD1(Naked cuticle homolog 1)和NKD2(Naked cuticle homolog 2)基因,NKDl、NKD2基因分别定位于染色体16q12.1及5p15.3上,研究发现NKD1、NKD2基因相关定位位点在肝癌、胃癌、乳腺癌等多种癌症中频繁的出现杂合性缺失(Loss of heterozygosity,LOH),包括乳腺癌、骨肉瘤在内的多种恶性肿瘤中均存在NKD1、NKD2基因m RNA表达水平异常及甲基化状态的改变。但是在口腔鳞癌的发生发展中,NKD1、NKD2基因的表达及甲基化状态尚无文献报道。因此本实验通过采用RT-PCR和MSP方法检测NKD1、NKD2基因的表达水平及甲基化状态,并分析其与OSCC各项临床病理特征之间的相关性,探讨NKD1、NKD2基因在OSCC的发生发展中的作用,为口腔鳞癌的早期诊断,早期治疗提供理论依据。方法:1标本均来源于2015年9月至2016年11月期间河北医科大学第四医院口腔科手术治疗的52例OSCC患者,以术中切除的OSCC组织作为实验组,以相对应癌旁2cm正常黏膜组织为对照组,实验组及对照组组织学诊断均经术后病理验证,标本于-80℃生物标本库中冻存。2采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR,Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)检测52例OSCC及相对应正常组织内NKD1、NKD2基因m RNA表达量。3应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP,Methylation Specific Polymerase Chain Reaction)检测52例OSCC及相对应正常组织内NKD1、NKD2基因启动子区Cp G岛甲基化状态。4应用SPSS21.0软件进行统计学分析,基因m RNA表达差异比较应用配对t检验,成组t或近似t检验;两基因m RNA表达相关性应用直线相关分析;基因甲基化的比较应用Fisher确切概率法或四格表χ2检验;两基因间甲基化相关性应用Spearman等级秩和相关分析。当P<0.05证明差异存在统计学意义。结果:1 NKD1基因m RNA相对表达量在OSCC组织中为0.50±0.12,低于其对应正常口腔黏膜组织0.66±0.18,二者差别有统计学意义(t=19.934,P<0.001)。临床Ⅰ期+Ⅱ期OSCC组织中NKD1基因m RNA相对表达量是0.53±0.12,高于临床Ⅲ期+Ⅳ期0.44±0.10(t=-3.041,P=0.004);有淋巴结转移组NKD1 m RNA的相对表达量0.44±0.10,低于无淋巴结转移组0.52±0.12(t=2.469,P=0.017);NKD1基因m RNA的相对表达量与年龄、性别和吸烟与否无相关性(P>0.05)。2 NKD2基因m RNA的相对表达量在OSCC组织中为0.42±0.10,低于其对应正常口腔黏膜0.62±0.12,二者差异有统计学意义(t=10.915,P<0.001)。临床Ⅰ期+Ⅱ期OSCC组织中NKD2基因m RNA相对表达量为0.44±0.10,高于临床Ⅲ期+Ⅳ期中0.37±0.05(t=-3.739,P<0.001);有淋巴结转移组0.37±0.07低于无淋巴结转移组0.45±0.10(t=2.873,P=0.006);吸烟组0.38±0.09低于不吸烟组0.45±0.08(t=-3.395,P=0.001);NKD2基因m RNA的相对表达量与性别及年龄无相关性(P>0.05)。3 NKD1基因甲基化阳性表达率在OSCC组织中48.08%(25/52)高于相对应正常口腔黏膜组织26.92%(14/52),二者差异有统计学意义(χ2=4.964,P=0.026)。临床Ⅰ期+Ⅱ期OSCC组织中NKD1基因甲基化率为35.48%(11/31),低于Ⅲ期+Ⅳ期66.67(14/21)(χ2=4.877,P=0.027);NKD1甲基化率在有淋巴结转移组中70.59%(12/17)高于无淋巴结转移组37.14%(13/35)(χ2=5.127,P=0.024);NKD1基因甲基化率与年龄、性别及吸烟无关(P>0.05)。4 NKD2基因甲基化阳性表达率在OSCC中44.23%(23/52)高于相应的正常口腔黏膜组织21.15%(11/52),两者差别有统计学意义(χ2=6.292,P=0.012)。临床Ⅰ期+Ⅱ期OSCC组织中NKD2基因甲基化率为29.03%(9/31),低于Ⅲ期+Ⅳ期66.67%(14/21)(χ2=7.188,P=0.007);有淋巴结转移组64.71%(11/17)高于无淋巴结转移组34.29%(12/35)(χ2=4.293,P=0.038);吸烟组57.14%(16/28)高于不吸烟组29.17%(7/24)(χ2=4.1,P=0.043)。NKD2甲基化阳性表达率与性别和年龄无关(P>0.05)。5在OSCC中,NKD1甲基化组m RNA相对表达量0.44±0.11低于非甲基化组m RNA表达量0.54±0.11(t=-3.344,P=0.002)。NKD2基因甲基化组m RNA相对表达量0.36±0.06低于非甲基化组m RNA的相对量0.47±0.09(t=-4.934,P<0.001)。6在OSCC中,NKD1、NKD2两基因均发生甲基化者共16例,均未发生甲基化者共20例,两基因甲基化状态在OSCC组织中呈正相关关系(r=0.038,P=0.005);NKD1、NKD2两基因m RNA相对表达量在OSCC组织中呈正相关关系(r=0.312,P=0.024)。结论:1 NKD1、NKD2基因m RNA相对表达下降或沉默可能参与OSCC的发生与发展。其中,NKD1基因异常表达与临床分期及淋巴结转移相关。NKD2基因异常表达与临床分期、淋巴结转移及吸烟有关。2 NKD1、NKD2基因启动子区Cp G岛高甲基化状态可能是OSCC发生的主要机制之一。其中,NKD1基因异常甲基化状态与临床分期及淋巴结转移有关。NKD2基因异常甲基化状态与临床分期、淋巴结转移及吸烟有关。3在OSCC中NKD1、NKD2基因高甲基化状态可能是致其m RNA表达下降或沉默的主要原因之一。4 NKD1与NKD2在OSCC的发生发展中可能存在协同作用。