自2005年瑞典科学家Allander等人首次在呼吸道感染患儿的鼻咽吸出物中发现人博卡病毒(Human bocavirus, HBoV)以来,又陆续发现了3个新的HBoV基因型别—HBoV2～4。这些病毒属于细小病毒科(Parvoridae)细小病毒亚科(Parvovirinae)的博卡病毒属(Bocavirus),是迄今发现的继细小病毒B19之后能感染人的第二类细小病毒。HBoV在世界各地均有报道,许多国家已经报道了在不同标本中(如呼吸道标本、粪便、血清等)检测出HBoVs,旦绝大部分的研究是针对HBoV1,对HBoV2～4的研究报道还很有限。从现有的资料来看,越来越多的临床证据支持HBoVl为下呼吸道感染的致病病毒,而HBoV2～4主要在腹泻患儿的粪便标本中检出,这些感染肠道的HBoVs尤其是HBoV2在粪便标本中的检出率要高于其它基因型别,提示它们可能与儿童的急性胃肠炎有关。目前为止,HBoV尚不能体外培养,也无动物模型建立,阻碍了其复制机制及致病机理的研究。为揭示其复制机制,有研究在临床标本中检测了HBoV1、3的头-尾DNA序列和环状游离体结构,并在此基础上成功构建了HBoV1的感染性克隆,以绕开上述瓶颈进行致病机理的研究。鉴于腹泻病在我国儿童疾病谱中的重要地位,本研究对HBoV2进行了初步研究,以明确其与小儿腹泻病的可能相关性；得到了HBoV2包括头-尾序列在内的完整基因组,这是国际上的首次报道；并尝试构建HBoV2的感染性克隆,为阐明这一病毒的复制模式和致病机制打下基础。首先,为了了解北京地区急性腹泻患儿中HBoV2的流行情况并了解这一病毒的基因组特征,收集了2010年11月至2012年10月到首都儿科研究所附属儿童医院门诊就诊的急性腹泻患儿的粪便标本1068例,应用针对HBoV2NS1基因的PCR引物进行荧光实时PCR检测。选择2例病毒载量较高的阳性标本进行HBoV2各基因片段的扩增并测序。将所测到的序列进行拼接后得到接近完整的HBoV2基因组序列并与GenBank中的相关序列进行比较分析。结果显示,所检测的2010年11月至2012年10月期间的1068例粪便标本中有24例HBoV2DNA检测阳性,阳性检出率为2.2%；各年龄组中,3-6月龄患儿中的HBoV2DNA阳性检出率最高,达3.6%(9/252),其次为6-9月龄(2.5%,5/203)的患儿,小于3月龄和大于3岁(含3岁)的患儿中未检测到HBoV2阳性标本；所检第一年度中,HBoV2日性检出率在7月最高,为7.0%(3/43),其次为9月(4.8%,2/41)和6月(4.8%,2/42),1-4月无阳性标本检出。第二年度中,HBoV2阳性检出率在9月最高,为4.5%(2/44),其次为7月(4.5%,2/45),11、12月及1-5月无阳性标本检出。24例HBoV2检测阳性的患儿除1例患儿年龄大于2岁以外,其余均为2岁以下儿童。其中5例患儿同时合并有诺如病毒感染、5例合并有轮状病毒感染、1例合并有腺病毒感染。经测序得到两株接近完整的HBoV2基因组序列BJQ19和BJQ390,长度分别为5273bp和5275bp；序列分析显示这两株序列的同源性为99.2%,与GenBank中来自中国上海的FJ375129株同源性最高,分别为99.1%和99.2%,为典型的HBoV2。上述结果表明,北京地区部分儿童的急性腹泻可能与HBoV2感染相关,且HBoV2感染在低年龄组腹泻儿童中更为常见。其次,为了明确HBoV2基因组是否存在头-尾相接的环状游离体结构,进一步对已确证为HBoV2(?)日性的24例急性腹泻患儿的粪便标本进行了头尾序列的测定。第一年度,通过巢式PCR检测发现2例标本有预期目的条带,经测序证实其中1例(BJQ435)为HBoV2头-尾序列阳性标本,随后对各个片段进行扩增和测序得到了HBoV2完整的环状基因组,标记为HBoV2-C1(GenBank序列号为JX257046)。第二年度,检出2例HBoV2头-尾序列阳性标本(Q1032和Q1089)并经测序证实。HBoV2-C1全长含5307个核苷酸,含4个开放读码框(Open Reading Frame, ORF)依次含1923、648、2004、1617个核苷酸,分别编码NS1、NP1、VP1(?)口VP2蛋白。基因组两端即在VP1/VP2和NS1基因之间有520个核苷酸长度的非编码区(Non-coding region, NCR),在HBoV2-C1末端连接头尾的序列中有约50个核苷酸是在以往报告的HBoV末端序列中未发现过的,是本研究的新发现。对BoV2-C1和HBoV3-E1(JN086998)的二级结构预测表明,与HBoV3-E1相比,HBoV2-C1的“发卡结构2”更为复杂,其带有一个额外的兔耳样结构；另外一个主要的不同是,HBoV2-C15’末端结构中的茎环结构比文献报道的HBoV3-E1的分布更为分散。上述结果表明HBoV2基因组存在含头-尾序列的环状结构,这一发现对于这一病毒的复制机制补充了新的资料。最后,在得到HBoV2环状基因组的基础上,进行了HBoV2全基因组重组质粒的构建。构建策略如下：①将基因组插入到适当的载体中,利用限制性内切酶将基因组切割下来,经凝胶电泳纯化后在体外使之自我环化,获得环状基因组。②设计含合适酶切位点的引物,利用扩增片段两端的酶切位点和载体自身的酶切位点,将其基因组分段依次插入到同一载体。将整个基因组分为4个片段进行扩增,其中采用重叠延伸PCR扩增得到了含头-尾序列的第四个片段HBoV2-4,并将各个片段插入到pGEM-T Easy载体得到了各个片段的重组质粒,然后通过酶切、连接反应及重叠延伸PCR扩增的方法将其余3个片段(HBoV2-1, HBoV2-2, HBoV2-3)拼接在一起,得到了含HBoV2-1+2+3片段的重组质粒。HBoV2-1+2+3和HBoV2-4经测序证实为HBoV2序列。全基因组的重组质粒仍在构建当中。综上所述,本研究进行了北京地区急性腹泻患儿中HBoV2的流行情况的初步调查并对这一病毒的基因组特征进行了分析；完成了HBoV2完整的基因组序列的测定分析,报道了HBoV2基因组存在头-尾相接的环状结构,这是国际上的首次报道；并在此基础上成功构建了HBoV2-1+2+3片段和HBoV2-4片段的重组质粒。上述研究结果为进一步深入研究HBoV2与儿童腹泻的关系及其致病机理打下了基础。