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细菌纤维素（Bacterial cellulose,BC）是由微生物发酵合成的一种纳米级生物高分子聚合物,。它具有良好的生物相容性和生物可降解性、高抗张强度、高化学纯度和高结晶度等优异的特性,使其广泛的应用于食品、医药、化妆品等领域。木糖驹形氏杆菌（Komagataeibacter xylinus）是目前研究最多的BC生产菌株。目前,有很多研究者通过优化发酵条件、筛选BC高产菌株或者培养过程中菌种的自发突变,来达到提高BC产量的目的,但是通过基因工程技术提高菌株自身BC合成能力的研究相对较少,其原因之一是缺少高效的遗传操作工具。因此,在K.xylinus中建立高效的基因编辑工具,将有助于对K.xylinus进行基因水平的调控,从而达到提高BC产量目的。本研究首先利用壮观霉素抗性基因aadA以及红色荧光蛋白编码基因mRFP1对lacIq-Ptrc启动子进行表征,以验证lacIq-Ptrc启动子在K.xylinus CGMCC 2955中的活性。结果发现,当IPTG的浓度为0.1～0.5 mM时,可以诱导lacIq-Ptrc启动子的表达,使菌株可以在添加壮观霉素的培养基中生长,并且在荧光显微镜下观察到红色荧光,表明lacIq-Ptrc启动子能够应用于K.xylinus CGMCC 2955中基因的表达调控。为了提高基因敲除的效率,同时达到无抗性基因标记的目的,本研究构建了pRedGx和pFLPGx辅助质粒,将lambda Red重组系统和FLP/FRT位点特异性重组系统应用于K.xylinus CGMCC 2955,并使用lacIq-Ptrc启动子分别调控两个质粒中Red重组酶和FLP翻转酶的诱导表达。利用该系统,成功敲除葡萄糖脱氢酶编码基因gdh,阻断了副产物葡萄糖酸的生成,该重组菌株被命名为K.xylinus GX03。通过对GX03菌株进行发酵验证,发现其BC产量明显降低,并且耗糖降低,表明葡萄糖脱氢酶的敲除影响了菌体对葡萄糖的吸收,进而影响了菌体代谢和BC的合成。通过在培养基中添加乙酸,以降低培养基的初始pH,部分恢复了GX03菌株的BC生产能力。此外,添加乙醇同样可以提高GX03菌株的BC产量。这是因为乙酸/乙醇作为能源物质供给菌体生长后,提高了菌体对葡萄糖的利用能力,从而有助于BC的合成。借助pFLPGx质粒,将GX03菌株中的pRedGX质粒以及整合至基因组中的氯霉素抗性基因进行消除,得到重组菌K.xylinus GX08,用于进一步研究。为了提高对葡萄糖的转运能力,本研究将来源于运动发酵单胞菌的葡萄糖促扩散蛋白Glf以及内源葡萄糖激酶编码基因glk在GX08菌株进行过表达,得到重组菌K.xylinus GX087;同时将pBla质粒分别转化至GX08和出发菌株K.xylinus CGMCC 2955中,得到K.xylinus GX081和K.xylinus GX06,作为空质粒对照菌株。结果表明,在初始pH为6.0条件下,GX087菌株的BC产量与对照菌GX06相近,但是耗糖却降低了一半;而在初始pH为5.0条件下,GX087菌株BC产量达到最高5.96 g/L,葡萄糖到BC的转化率为0.4 g/g,比GX06菌株的最高产量（初始pH值为6.0,4.36 g/L）提高了36.73%,葡萄糖到BC的转化率提高到了121.28%。为揭示gdh基因的敲除影响K.xylinus CGMCC 2955的BC产量和特性的机制,本研究通过代谢组学和转录组学的分析手段,揭示细胞代谢和基因转录水平的调控模式。由转录组学的结果可知,gdh基因的敲除显著抑制了GX081和GX087菌株的PP（pentose phosphate）途径、ED（Entner Doudoroff）途径以及EMP（Embden–Meyerhof–Parnas）途径产能阶段中相关基因的表达。而丙酮酸代谢途径中相关基因的表达上调有助于促进乙酰CoA的合成。相对于初始pH为6.0,在初始pH为5.0条件下,GX081和GX087菌株中的泛酸激酶编码基因的表达水平下调,可能是在初始为5.0条件下,促进了乙酰CoA的合成,而乙酰CoA对泛酸激酶的表达具有反馈抑制作用,所以导致泛酸激酶的编码基因转录下调。与GX06菌株相比,GX081和GX087菌株中参与氧化磷酸化反应中复合体I亚基合成的NuoG（CT154＿03680）、NuoH（CT154＿03685）、NuoI（CT154＿03690）、NuoJ（CT154＿03695）、NuoK（CT154＿03700）、NuoL（CT154＿03705）和NuoN（CT154＿03710）的编码基因发生上调,从而促进NADH的氧化以及电子传输效率。通过分析不同初始pH条件下GX081和GX087菌株中与葡萄糖转运相关基因的表达情况,结果表明,菌株可能是通过GalP和Glk将葡萄糖转运至胞内并进行磷酸化,进而参与菌体代谢。与GX06菌株相比,GX081和GX087菌株中纤维素合酶的编码基因bcsA、bcsB、bcsC、bcsABⅡ、bcsABⅢ、bcsCⅢ均发生上调,并且GX087菌株中的bcsB、bcsC、bcsABⅡ、bcsABⅢ和bcsCⅢ基因的上调程度更大（Log2Fold Change＞1,Padj＜0.05）。代谢组学结果表明,当培养基的初始pH值为6.0时,GX081菌株胞内的葡萄糖含量显著低于对照菌GX06。在初始pH值为5.0条件下,GX081菌株胞内的海藻糖和纤维二糖积累量均高于GX06菌株,而GX087菌株胞内的海藻糖和纤维二糖积累量均低于GX06菌株,海藻糖作为一种细胞保护性物质,其在GX081菌株中的积累可能是由于gdh基因的敲除严重影响了菌体代谢导致的,GX081菌株通过积累海藻糖抵御不利的环境。