牙周炎是牙周菌斑微生物感染导致牙周组织破坏的慢性感染性疾病,宿主免疫应答和炎症反应在牙周支持组织破坏过程中起十分关键的作用。对机体免疫反应在牙周病发病机制中作用的研究近年来一直是牙周病研究的热点。TLR4(Toll like receptor4)作为Toll样受体家族中最重要的成员,是革兰氏阴性菌脂多糖的天然受体分子,在哺乳动物先天性免疫应答反应及适应性免疫调节过程中均起关键性作用。因此,本课题拟检测TLR4在体外分离培养人牙周膜细胞(periodontal ligamentcells,后文简称PDLCs)中的表达,并探讨TLR4在PDLCs参与牙周组织细胞免疫应答过程中的作用及机制,以初步揭示牙周病发生发展的免疫机制。　　 目的：本研究在体外分离培养人PDLCs的基础上,研究TUR4在PDLCs中的表达情况,探讨TLR4在PDLCs受大肠杆菌脂多糖(Escherichia coli lipopolysaccride,E.coli LPs)刺激发生免疫应答反应过程中的作用,并进一步探讨其作用的分子机制,以了解牙周病发生发展过程中可能的免疫机制。　　 方法：　　 1、采用组织块法体外分离培养PDLCs、采用MTT法研究PDLCs在体外的生长的特性,绘制生长曲线,并检测波形丝蛋白(Vimentin)的表达,以确定其生物学来源及特性。　　 2、通过RT-PCR和免疫荧光技术分别检测TLR4及其相关分子CD14、MD-2在PDLCs中的基因及蛋白表达情况,采用流式细胞仪技术检测TLR4在PDLCs中的阳性表达率,并探讨LPS刺激对TLR4表达的影响。　　 3、分别采用半定量PCR,IELISA方法检测体外培养的PDLCs受LPS作用后细胞中IL-8基因表达量的变化及细胞上清液中IL-8的蛋白水平,并运用western blot技术检测NF-κB信号传导通路中I-κB的水平变化及NF-κB P65蛋白亚基核转位情况,通过采用小鼠抗人anti-TLR4单克隆抗体阻断PDLCs中表达的TLR4,研究其对PDLCs产生IL-8免疫应答的影响。　　 结果：　　 1、通过组织块法在体外能有效分离培养PDLCs,体外培养的PDLCs表现为成纤维细胞样形态；能稳定地培养与扩增:生长曲线的研究表明第5代、第10代一直到第15代细胞依然具有较好的生长动力学特征；细胞中Vimentin表达阳性而CK表达阴性,表明细胞来源于中胚层。　　 2、RT-PCR、免疫荧光以及流式细胞检测结果显示,PDLCs中均存在一定的TLR4基因、蛋白表达,LPS刺激能上调PDLCs中TLR4基因水平,反复传代细胞表面表达的TLR4水平下降。　　 3、半定量RT-PCR及ELISA检测结果显示,anti-TLR4单克隆抗体能阻断LPS诱导PDLCs中IL-8基因水平表达上调及细胞产生IL-8的免疫应答过程,Western blot结果进一步证实,anti—TLR4单克隆抗体能抑制LPS诱导PDLCs胞浆中I-κB降解,从而阻断NF-κBP65蛋白亚基转位至细胞核的免疫信号传导过程。　　 结论：本实验结果显示,LPS能诱导体外培养的PDLCs发生免疫应答反应使其产生趋化因子IL-8。TLR4在部分PDLCs中表达,表达于PDLCs中的TLR4参与LPS诱导免疫应答过程,NF-κB是TLR4识别LPS信号传导通路中的关键性分子。