【摘 要】
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抗生素滥用导致的耐药性问题已成为全世界急需解决的难题。β-内酰胺类抗生素是目前应用最广泛,临床依赖性最高的一类抗生素,其滥用导致了耐药菌的出现及广泛传播,严重威胁人们的生命健康。本文利用拉曼光谱技术对β-内酰胺类耐药菌进行检测,对其产酶过程进行实时监测,建立耐药细菌的单细菌拉曼成像技术,设计合成了一系列碳青霉烯类耐药菌拉曼探针。另外,本文还利用Gap-LCR反应对GmSg-1基因进行了可视化标记和
【基金项目】
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国家自然科学基金（21977053）； 山西省重点研发项目（201803D221020-2）； 山西省自然科学基金（201601D011076,201901D111225）；
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抗生素滥用导致的耐药性问题已成为全世界急需解决的难题。β-内酰胺类抗生素是目前应用最广泛,临床依赖性最高的一类抗生素,其滥用导致了耐药菌的出现及广泛传播,严重威胁人们的生命健康。本文利用拉曼光谱技术对β-内酰胺类耐药菌进行检测,对其产酶过程进行实时监测,建立耐药细菌的单细菌拉曼成像技术,设计合成了一系列碳青霉烯类耐药菌拉曼探针。另外,本文还利用Gap-LCR反应对GmSg-1基因进行了可视化标记和检测。主要研究结果如下:1.利用拉曼共振小分子探针头孢硝噻吩的off-on拉曼活性,对β-内酰胺酶及β-内酰胺类抗生素耐药菌进行拉曼检测。由于头孢硝噻吩作为一代头孢类抗生素,可直接刺激细菌产生β-内酰胺酶,其水解产物不断积累,导致其拉曼检测的高灵敏度和高信噪比,对ELBLs进行检测限的测定可达到0.4ng/L,对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌的检测可低至103cfu/m L,比目前现有的检测方法低1000倍。测定头孢硝噻吩被ELBLs水解的Vmax为24.54μmol/L/min,km为65.12μmol/L,kcat为236.46s-1以及ELBLs对硝基苯的催化效率(kcat/km)为3.63s-1μmol/L-1,最佳监测波长为633 nm,拉曼共振增强因子为352。同时建立了拉曼光谱技术对耐药细菌的药敏性检测,检测样本浓度为105cfu/mL,耗时30min,极大的提高了检测效率。2.建立单细菌拉曼成像技术,检测单个细菌的耐药性。首先通过细菌表面的多糖结构将活细菌固定到基底上,并保持其正常的生理状态不受影响。再通过共聚焦拉曼光谱仪对耐药菌产酶水解探针的拉曼信号进行原位采集,监测单个耐药菌在药物刺激后90～115min内β-内酰胺酶产生过程,并发现杆状细菌的β-内酰胺酶最先出现在细菌的两端。样本需求量为100个细菌,探针浓度为0.5mmol/L,1306cm-1处的拉曼信号为检测指标。首次利用细菌产酶能力作为细菌活性的生理指标,并建立拉曼成像药敏断点检测平台。最终测得细菌对环丙沙星的药敏断点为0.32μg/L,对妥布霉素的药敏断点为1.28μg/L,从样本采集到拿到用药方案仅需150min。3.借鉴头孢硝噻吩分子结构,将带有强吸电性共轭基团的4-溴-N,N,N-三甲基苯胺与碳青霉烯类抗生素母核偶联,设计、制备专一性检测碳青霉烯酶的小分子拉曼探针,将其命名为MEM-TA,其同样存在off-on拉曼活性,水解后在1285cm-1处产生强烈的拉曼信号。配置0.5mmol/L的MEM-TA对10种含有碳青霉烯酶的耐药细菌进行拉曼成像监测,结果表现出明显的抗性差异。碳青霉烯类抗生素作为细菌感染的最后防线,快速实现碳青霉烯类抗生素耐药在临床治疗过程中具有极大的意义和价值。4.根据GmSg-1a/GmSg-1b基因433 SNP位点的A/G变异,分别设计了GmSg-1a和GmSg-1b基因各自的特异性互补探针L*、R、L、R*。通过优化Gap-LCR反应体系,结果表明模板浓度0.06μmol/L、缓冲液pH值8.4、探针浓度1.2μmol/L为最优反应体系。对Gap-LCR反应程序进行了优化,延伸时间1 min即可完成Gap-LCR反应,大大缩短了反应时间。显色反应的最优体系为hemin（1μmol/L）,ABTS（1μmol/L）,H2O2（2mmol/L）,室温涡旋10min。最终GmSg-1a和GmSg-1b基因的检测限为0.16μmol/L。
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