目的:随着经济社会的发展以及环境的变化,皮肤鳞状细胞癌(SCC)不仅在我国而且在世界范围内的发病率逐年升高,这给人类的健康造成了巨大的威胁。目前对于SCC的治疗主要以手术及放射治疗为主,而药物治疗方面疗效欠佳。双胍类药物二甲双胍是广泛用于临床治疗II型糖尿病的药物。有针对糖尿病患者的流行病学研究分析表明二甲双胍的使用与降低各种类型的实体肿瘤发病率具有显著相关性。由于二甲双胍能够增强人体对胰岛素的敏感性同时降低对葡萄糖的吸收,因此对糖代谢有关的肿瘤细胞具有抑制作用。随着研究的不断的深入,二甲双胍对体内外抗肿瘤活性方面的作用越来越受到人们的重视。研究证实二甲双胍能够抑制小鼠SCC肿瘤的生长,但其抑制肿瘤细胞生长和诱导癌细胞凋亡的机制尚未完全阐明。核转录因子(NF-κB)控制许多关键生理反应基因的表达,包括免疫和急性期炎症反应、细胞粘附、分化、氧化应激反应和细胞凋亡。而p65作为NF-κB家族重要的成员之一,在许多肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。其在A431肿瘤细胞中也广泛表达。而c-myc作为NF-κB的下游基因过表达对肿瘤细胞的增殖及转移起着很大的作用。因此本实验通过探讨二甲双胍对A431肿瘤细胞的抑制作用及p65、p-p65、c-myc表达的影响,探寻二甲双胍对SCC作用的新机制。方法:1细胞来源:本实验使用的细胞来源于人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431.2实验分组及干预:实验以IMDM培养基中二甲双胍的药物浓度不同进行分组,设1m M、2.5m M、5m M、10m M共4个实验组。以不加药物组为对照组。3采用CCK-8法检测各组细胞在24h、48、72h OD值,计算出细胞增殖抑制率。4采用免疫荧光检测对照组与10m M组细胞中p65的表达。5采用蛋白质免疫印迹(western blot)技术检测各组细胞总蛋白中p65、胞浆中p65、细胞核中p-p65及c-myc的蛋白表达量。6采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测各组细胞中p65、c-myc基因转录水平表达。7统计学分析:采用SPSS19.0软件统计分析,计量资料采用(?)±s表示,并采用单因素方差分析,组间的两两比较采用SNK-q检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1在同样的时间下,二甲双胍的药物浓度(1m M、2.5m M、5m M、10m M)的增加A431细胞的抑制率的影响:从对照组与10m M的药物浓度组24h及72h细胞的形态比较发现二甲双胍对A431细胞增殖有明显的抑制作用。药物刺激24h后,各组抑制率分别为:(5.18±0.76)%、(8.05±2.08)%、(14.39±1.77)%、(17.85±0.60)%,组间差异具有统计学意义(F=63.913,P=0.000<0.05)。药物刺激48h后,各组抑制率分别为:(7.79±0.27)%、(11.97±0.70)%、(19.14±0.80)%、(32.06±2.07)%,组间差异具有统计学意义(F=330.990,P=0.000<0.01)。药物刺激72h后,各组抑制率分别为:(9.27±0.70)%、(14.93±1.32)%、(21.31±0.95)%、(37.09±2.80)%,组间差异具有统计学意义(F=209.890,P=0.000<0.01)。可见在同一时间下二甲双胍对细胞抑制率的影响具有一定的浓度依赖性。2在相同药物浓度刺激下,随着时间的增加,药物对细胞的影响:1m M组:24h、48h、72h细胞抑制率差异有统计学意义(F=45.532,P=0.000<0.01),2.5m M组:24h、48h、72h细胞抑制率差异有统计学意义(F=21.806,P=0.000<0.01),5m M组:24h、48h、72h细胞抑制率差异有统计学意义(F=32.237,P=0.000<0.01),10m M组:24h、48h、72h细胞抑制率差异有统计学意义(F=95.631,P=0.000<0.01)。可见在相同药物浓度刺激下,二甲双胍对细胞的抑制率具有时间的依赖性。3免疫荧光实验观察二甲双胍作用于细胞后,p65在细胞核及细胞浆的分布情况:二甲双胍处理细胞24小时后,可见10m M药物浓度的细胞核中p65的表达明显少于对照组。4药物刺激细胞24h后随着药物浓度(0m M、1m M、2.5m M、5m M、10m M)的增加对细胞总蛋白p65蛋白表达的影响:各组蛋白相对表达量分别为:1.11±0.07、1.09±0.06、0.93±0.04、0.92±0.04、0.43±0.03,组间差异有统计学意义(F=89.018,P=0.000<0.01)。可见随着药物浓度的增加总蛋白p65的相对表达量下降,具有浓度依赖性。5药物刺激细胞24h后随着药物浓度(0m M、1m M、2.5m M、5m M、10m M)的增加对细胞浆p65蛋白表达的影响:各组蛋白相对表达量分别为:0.50±0.04、0.53±0.02、0.78±0.04、0.79±0.03、0.82±0.02,组间差异有统计学意义(F=76.789,P=0.000<0.01)。可见随着药物浓度的增加胞浆p65的相对表达量升高,具有一定的浓度依赖性。6药物刺激细胞24h后随着药物浓度(0m M、1m M、2.5m M、5m M、10m M)的增加对细胞核p-p65蛋白表达的影响:各组蛋白相对表达量分别为:0.22±0.01、0.18±0.02、0.17±0.01、0.14±0.02、0.12±0.01,组间差异有统计学意义(F=23.844,P=0.000<0.01)。可见随着药物浓度的增加细胞核p-p65的相对表达量下降,具有浓度依赖性。7药物刺激细胞24h后随着药物浓度(0m M、1m M、2.5m M、5m M、10m M)的增加对细胞核中c-myc蛋白表达的影响。各组蛋白相对表达量分别为:0.85±0.07、0.79±0.06、0.50±0.02、0.27±0.04、0.18±0.03,组间差异有统计学意义(F=130.910,P=0.000<0.01)。可见随着药物浓度的增加细胞核c-myc的相对表达量下降,具有浓度依赖性。8 q RT-PCR技术检测不同浓度的二甲双胍(0m M、1m M、2.5m M、5m M、10m M)对A431细胞中p65 m RNA的相对表达量分别为:1.00±0.00、0.85±0.12、0.60±0.13、0.51±0.14、0.24±0.09。组间差异有统计学意义(F=22.808,P=0.000<0.01)。c-myc m RNA的相对表达量分别为:1.00±0.00、0.83±0.05、0.70±0.07、0.70±0.16、0.44±0.13。组间差异有统计学意义(F=13.208,P=0.001<0.01)。结论:1二甲双胍对A431细胞增殖具有抑制作用2二甲双胍可降低p65、c-myc在A431细胞中的表达,并可抑制p65的磷酸化。