研究背景与目的白血病是在造血过程中由于某一阶段细胞克隆扩增而产生的造血系统恶性疾病,在我国发病率约为4-5/10万,是青少年死亡的首位疾病。近来,随着污染的逐渐加剧,累积损伤造成白血病发病率越来越高,难治性越来越强。目前认为,白血病中存在具有长期自我更新能力的白血病干细胞,是白血病发病的根源,也是白血病治疗后耐药和复发的主要根源。由于白血病干细胞处于细胞分裂的休眠期(Go期),使其对常规剂量药物和放射损伤产生强大的抵抗力,甚至对人体致死剂量药物(Bu 16mg/kg和Cy 60mg/kg)和全身照射(1100cGy)也产生耐受和抵抗。白血病在机体的发生历经了免疫监视、相互对抗和免疫逃逸的免疫选择和编辑过程,因此白血病细胞能通过基因突变等多种机制逃逸机体的免疫监视,尤其是具有强大增殖能力的白血病干细胞。逃逸后的白血病干细胞获得克隆性增殖,最终发展成白血病状态。如何最大限度的清除耐药和免疫抵抗的白血病细胞是降低白血病复发和治愈白血病的关键。近来发现,在食用性植物中,存在着一大类结构不同的化合物——植物多酚,富含该类化合物的食物和饮料消费与癌症低发密切相关。动物实验表明该类化合物能抑制化学诱发的肿瘤发生,有效抑制肿瘤诱发、促进和发展多个阶段,抑制肿瘤细胞集落形成,延长荷瘤裸鼠的生存期,提示它们可能是在肿瘤干细胞水平上起作用,这为清除药物和免疫耐受的白血病干细胞提供了新的干预方法。因此,本实验以含有白血病干细胞的CD34+早期急性髓系白血病KG-1a细胞为靶细胞,采用白藜芦醇和姜黄素2种植物多酚为干预手段,联合细胞因子激活的免疫细胞,以细胞增殖,细胞周期,细胞凋亡,杀伤效率和克隆形成率等指标,观察KG-1a细胞被活化免疫细胞杀伤敏感性的变化,探讨免疫激活物受配体(NKG2D和DNAM1)和外源性凋亡通路(FaS和TRAIL)在该作用中的机制,为有效清除白血病干细胞提供理论和实验依据,为治愈白血病提供新方法。方法第一章植物多酚对CD34+早期急性髓系白血病细胞生物学活性的影响利用细胞涂片,台盼蓝染色细胞计数,流式细胞术和半固体培养法等方法选择含有白血病干细胞的细胞株作为后续的靶细胞。选择白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞增殖的50%有效抑制浓度,观察细胞形态变化,荧光显微镜和流式细胞术检测细胞凋亡变化,流式细胞术检测细胞周期和表面标记的变化,半固体培养法检测细胞克隆形成率,分光光度法检测caspase8的活性,比较白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞生物学活性的影响。第二章植物多酚对活化免疫细胞杀伤CD34+早期急性髓系白血病细胞的影响分离正常健康人的外周血单个核细胞,加入细胞因子激活单个核细胞。利用细胞涂片,流式细胞术和LDH释放法,对活化免疫细胞进行鉴定。将白藜芦醇和姜黄素与KG-1a细胞作用24h后,存活的细胞与不同比例的活化免疫细胞共培养,倒置相差显微镜观察活细胞形态变化,LDH检测杀伤效率,半固体培养法检测克隆形成率。第三章植物多酚对CD34+早期急性髓系白血病细胞免疫激活物和外源性凋亡通路死亡受体的调节流式细胞术检测KG-1a细胞表面免疫激活物的表达,包括NKG2D配体,DNAM1配体,Fas和配体,TRAIL和受体的变化。加入TRAIL纯化蛋白后,XTT试剂盒检测KG-1a细胞增殖率,半固体培养法检测克隆形成率,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,分光光度法检测caspase8的变化,real-time PCR检测凋亡相关基因mRNA。第四章植物多酚作用后的CD34+早期急性髓系白血病细胞对活化免疫细胞的影响将白藜芦醇和姜黄素与KG-1a细胞作用24h后,再用活化免疫细胞以效靶比为10：1进行杀伤4h,对KG-1a细胞作用后的活化免疫细胞表面的NKG2D和DNAM1,Fas和配体,TRAIL和受体及凋亡的变化进行流式细胞术检测,对作用前后的活化免疫细胞内caspase8活性用分光光度法进行检测。统计学方法应用SPSSl3.0软件进行数据处理,数据以均数±标准差(x±s)表示,统计方法主要包括单因素方差分析法,若方差不齐,采用校正的F检验Welch法代替。方差齐时组间多重比较采用LSD法,方差不齐时组间多重比较采用Dunnett’s T3法。两两比较采用配对t检验。多因素分析采用析因分析。P<0.05提示差异有统计学意义。结果第一章植物多酚对CD34+早期急性髓系白血病细胞生物学活性的影响1.1 CD34+早期急性髓系白血病KG-1a细胞的特性倒置相差显微镜下观察KG-1a细胞和HL-60细胞,圆形透亮,大小均一,折光性好,边缘清晰。细胞涂片瑞氏-吉姆萨染料染色后观察,KG-1a细胞核浆比大,胞浆出现空泡,未见颗粒,胞核体积大,染色质疏松,可见大量核仁；HL-60细胞核浆比较小,胞浆出现大量颗粒,胞核体积较小,染色体较致密,核仁少见。KG-la细胞的对数倍增时间为24.24h,长于HL-60细胞15.83h。KG-1a细胞表达CD34抗原,部分缺失表达CD38抗原；HL-60细胞不表达CD34和CD38抗原。KG-1a细胞14d的克隆形成率低于HL-60细胞的克隆形成率,但21d的克隆形成率KG-1a细胞高于HL-60细胞克隆形成率,提示KG-1a细胞比HL-60细胞处于更早的分化阶段,并有大量细胞处于白血病干细胞阶段。1.2植物多酚对CD34+早期急性髓系白血病细胞的生物学活性的影响1.2.1白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞生长的抑制作用白藜芦醇和姜黄素均能有效抑制KG-1a细胞的增殖,随着浓度的增加和作用时间的延长,存活的KG-1a细胞逐渐减少,呈剂量和时间依赖性。不同浓度白藜芦醇对外周血单个核细胞增殖有一定的抑制作用,但是25-100umol/L的白藜芦醇对外周血单个核细胞增殖无明显影响。25umol/IL白藜芦醇对KG-1a细胞24h和48h的抑制率均为50%,而该浓度对正常的单个核细胞增殖并无抑制作用。因此,将25umol/L的白藜芦醇作为后续研究的干预因素。不同浓度姜黄素对外周血单个核细胞增殖的抑制作用较明显,但在12.5umol/L时抑制作用较小,而该浓度作用24h对KG-la细胞增殖的抑制率可达到50%。因此,将12.5umol/L的姜黄素作为后续研究的干预因素。1.2.2白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞形态和细胞核形态的影响倒置相差显微镜镜下观察,对照组KG-1a细胞圆形透亮,胞膜完整光滑,细胞碎片较少。而白藜芦醇和姜黄素作用24h后的KG-1a细胞出现细胞形状不规则、胞浆颗粒增多,甚至出现细胞碎片。DAPI染色,荧光显微镜下观察,对照组KG-la细胞胞核染色均一,形状规则,核膜完整,而白藜芦醇和姜黄素作用24h后的KG-la细胞核形状不规则,染色不均一,核膜不完整,甚至呈菜花状和碎片状。1.2.3白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞克隆形成率的影响甲基纤维素半固体培养,KG-1a细胞接种后第14天可形成>50个细胞组成的集落,随着时间延长,集落不断增大,集落数量不断增多,第21天达到高峰,随后集落中的细胞逐渐死亡,集落随之松散。与对照相比,白藜芦醇和姜黄素处理后KG-la细胞14天和21天的克隆数明显减少,提示白藜芦醇和姜黄素均能抑制KG-1a克隆形成细胞。1.2.4白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞周期的影响流式细胞术检测细胞周期变化,与对照组比较,25umol/L白藜芦醇作用后的KG-la细胞,G0/G1期细胞增多,S期和G2/M期细胞相对减少,提示白藜芦醇将KG-la细胞周期阻滞在G0/G1期；12.5umol/L姜黄素作用后的KG-1a细胞,细胞周期无明显变化。1.2.5白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞表面CD34CD38抗原表达的影响流式细胞术检测细胞表面标记CD34CD38的变化,白藜芦醇能减少KG-1a细胞中较晚期干细胞的比例,使细胞停留在较原始的阶段,而姜黄素则能减少KG-la细胞中原始干细胞的比例,使细胞向成熟阶段分化。1.2.6白藜芦醇和姜黄素诱导KG-1a细胞凋亡的作用流式细胞术检测和荧光显微镜下观察,白藜芦醇和姜黄素均能诱导KG-la细胞凋亡。1.2.7白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞caspase8活性的影响分光光度法检测caspase8的活性变化,与对照组比较,白藜芦醇和姜黄素处理12h后均能提高caspase8活性,随着时间延长caspase8活性下降。第二章植物多酚对活化免疫细胞杀伤CD34+早期急性髓系白血病细胞的影响2.1活化免疫细胞的特性2.1.1活化免疫细胞的形态倒置相差显微镜下观察,细胞呈克隆样悬浮生长,聚团紧密,细胞胞体较小,圆形透亮,边缘光滑。瑞氏-吉姆萨染色细胞涂片观察,细胞圆形,较小胞浆蓝色,无颗粒,胞核染色质致密,符合典型淋巴细胞的特性。2.1.2活化免疫细胞凋亡和细胞周期的分布细胞因子IL-2和IL-15激活的活化免疫细胞发生自发凋亡的比例低,且大多细胞处于细胞周期的G0/G1期,不易被外环境所激活。2.1.3活化免疫细胞活化性受体的表达活化免疫细胞NKG2D的表达为(51.27±7.41)%,DNAM1的表达为(47.10±3.21)%,提示外周血单个核细胞在细胞因子IL-2和IL-15作用下能被激活表达活化性受体。2.1.4活化免疫细胞外源性凋亡通路Fas/FasL和TRAIL的表达活化免疫细胞TRAIL的表达为(44.17±7.22))％,Fas为(89.03±7.14)%,FasLigand为(19.20±4.70)%。2.1.5活化免疫细胞对K562杀伤功能的检测LDH法检测对K562的杀伤效率,效靶比10：1时为(61.67±16.47)%,20：1时为(85.56±8.88)%,提示在抑制性受体的配体MHC-I类分子缺失的状态下,活化免疫细胞具有很高的杀伤活性。2.2植物多酚对活化免疫细胞杀伤CD34+早期急性髓系白血病细胞的影响2.2.1 LDH法检测白藜芦醇和姜黄素对活化免疫细胞杀伤KG-1a细胞的影响白藜芦醇和姜黄素作用后的KG-1a细胞,与活化免疫细胞共培养,倒置相差显微镜下观察,活化免疫细胞体积较小,紧密围绕在胞体较大的KG-1a细胞周围。LDH法检测杀伤率,在效靶比为10：1时,白藜芦醇和姜黄素能提高活化免疫细胞对KG-1a细胞的杀伤效率,而在效靶比为20：1时,白藜芦醇能提高活化免疫细胞对KG-1a细胞的杀伤效率,而姜黄素则不能提高杀伤效率。2.2.2白藜芦醇和姜黄素对活化免疫细胞杀伤KG-1a克隆形成细胞的影响半固体培养法检测白藜芦醇和姜黄素对活化免疫细胞杀伤KG-la克隆形成细胞的影响。结果显示,活化免疫细胞不能杀伤KG-1a14天克隆形成细胞,但能杀伤KG-1a21天克隆形成细胞；白藜芦醇不能增强活化免疫细胞杀伤KG-1al4天克隆形成细胞的敏感性,但能增强活化免疫细胞杀伤KG-1a21天克隆形成细胞的敏感性；姜黄素能增强活化免疫细胞杀伤KG-1a14天和21天克隆形成细胞的敏感性。第三章植物多酚对CD34+早期急性髓系白血病细胞免疫激活物和外源性凋亡通路死亡受体的调节3.1白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞NKG2D配体MICA,MICB,ULBP1,ULBP2和ULBP3表达的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞NKG2D配体MICA, MICB, ULBP1, ULBP2和ULBP3表达的影响。结果显示,姜黄素能提高MICA和MICB的表达,而白藜芦醇能提高ULBP1,ULBP2和ULBP3的表达。3.2白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞DNAM1配体CD112和CD155表达的影响的表达流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素对DNAM1配体CD112和CD155表达的影响。结果显示,白藜芦醇能下调KG-1a细胞CD112的表达,而姜黄素则能下调KG-la细胞CD112和CD155的表达。3.3白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞Fas和Fas Ligand表达的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素对Fas和Fas Ligand表达的影响。结果显示,白藜芦醇不能影响KG-1a细胞Fas和Fas Ligand的表达,但姜黄素能下调KG-1a细胞Fas Ligand的表达。3.4白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞TRAIL通路的影响3.4.1白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞TRAIL,死亡受体DR4/5和诱骗受体DcR1/2表达的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素TRAIL,死亡受体DR4/5和诱骗受体DcRl/2表达的影响。结果显示,白藜芦醇能提高KG-1a细胞死亡受体DR5的表达,下调诱骗受体DcR1的表达,而姜黄素不能提高死亡受体DR4/5的表达,但能下调诱骗受体DcRl的表达。3.4.2 TRAIL联合白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞的杀伤作用XTT试剂检测不同浓度TRAIL对25umol/L白藜芦醇和12.5umol/L姜黄素作用前后KG-1a细胞增殖的影响。结果显示,白藜芦醇能增强TRAIL对KG-1a细胞的细胞毒作用,与浓度无关；而姜黄素不能增强TRAIL对KG-1a细胞的细胞毒作用。因此,选择10ng/ml作为后续TRAIL实验的靶浓度。3.4.3 TRAIL联合白藜芦醇和姜黄素对KG-1a细胞克隆形成率的影响半固体培养法检测TRAIL对白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞的克隆形成率的影响。结果显示,TRAIL对KG-1a细胞14天和21天的克隆形成细胞均无抑制作用；白藜芦醇能增强TRAIL对KG-1a细胞21天克隆形成细胞的抑制作用,但对14天克隆形成细胞无影响；.姜黄素不能增强TRAIL对KG-1a细胞21天克隆形成细胞的抑制作用,反而促进KG-1a细胞14天的克隆形成。3.4.4 TRAIL联合白藜芦醇对KG-1a细胞周期的影响流式细胞术检测TRAIL对白藜芦醇作用后KG-1a细胞的细胞周期影响。结果显示,TRAIL作用前后的KG-la细胞和KG-la/RES,细胞周期均无明显变化,提示TRAIL不影响KG-1a细胞周期的变化。3.4.5 TRAIL联合白藜芦醇对KG-1a细胞凋亡的影响流式细胞术检测TRAIL对白藜芦醇作用后KG-1a细胞凋亡的影响。结果显示,白藜芦醇能促进TRAIL诱导KG-1a细胞发生晚期凋亡和死亡。3.4.6 TRAIL联合白藜芦醇对KG-1a细胞caspase8活性的影响分光光度法检测TRAIL对白藜芦醇作用后KG-1a细胞凋亡相关蛋白caspase8活性的影响。结果显示,TRAIL不能上调KG-1a细胞caspase8的活性,白藜芦醇也不能增强TRAIL上调KG-1a细胞caspase8的活性。3.4.7 TRAIL联合白藜芦醇对KG-1a细胞抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl的影响实时定量RT-PCR检测TRAIL对白藜芦醇作月后KG-1a细胞凋亡相关基因bcl-2和bcl-xl的影响。结果显示,TRAIL能下调KG-1a细胞抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl的表达,白藜芦醇能增强TRAIL下调KG-1a细胞bcl-2基因表达,但不能增强TRAIL下调KG-1a细胞bcl-xl基因的表达。第四章植物多酚作用后的CD34+早期急性髓系白血病细胞对活化免疫细胞的影响4.1白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞活化性受体的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞活化性受体表达的影响。结果显示,未处理组KG-1a细胞与活化免疫细胞作用4h后,活化免疫细胞NKG2D和DNAM1的表达无明显变化,白藜芦醇和姜黄素干预后的KG-1a细胞能下调活化免疫细胞表面DNAM1的表达,对NKG2D的表达无影响。4.2白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞Fas/FasL表达的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞Fas/FasL表达的影响。结果显示,未处理组KG-1a细胞与活化免疫细胞作用4h后,Fas和FasL表达均无明显变化,白藜芦醇和姜黄素干预后的KG-1a细胞均能下调活化免疫细胞表面Fas和FasL的表达。4.3白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞TRAIL和受体表达的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞TRAIL受体表达的影响。结果显示,未处理组KG-1a细胞能下调TRAIL死亡受体DR4/5的表达,但同时上升诱骗受体DcRl的表达,对诱骗受体DcR2的表达无影响,白藜芦醇和姜黄素干预后的KG-1a细胞能下调活化免疫细胞表面TRAIL,死亡受体DR4/5和诱骗受体DcRl/2的表达。4.4白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞凋亡的影响流式细胞术检测白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞凋亡的影响。结果显示,杀伤KG-la细胞后活化免疫细胞的凋亡率升高,杀伤白藜芦醇和姜黄素处理KG-1a细胞后活化免疫细胞的凋亡率升高更为明显。4.5白藜芦醇和姜黄素作用后KG-1a细胞对活化免疫细胞caspase8活性的影响分光光度法检测白藜芦醇和姜黄素干预后的白血病细胞对活化免疫细胞caspase8活性的影响。结果显示,与活化免疫细胞作用4h后与Oh比较,未处理组KG-1a细胞能增强活化免疫细胞内caspase8活性,而白藜芦醇和姜黄素作用后的KG-1a细胞则对活化免疫细胞内caspase8活性无影响。结论1.白藜芦醇和姜黄素能抑制含有白血病干细胞的CD34+早期急性髓系白血病KG-1a细胞增殖,抑制KG-1a细胞14天和21天的克隆形成,说明对白血病干细胞有直接作用。2.白藜芦醇和姜黄素诱导KG-1a细胞发生凋亡。3.白藜芦醇提高KG-1a细胞ULBP1-3的表达,姜黄素提高KG-la细胞MICA/B的表达,从而激发免疫细胞杀伤能力。4.白藜芦醇上调KG-1a细胞表面死亡受体DR5表达,下调诱骗受体DcR1和抗凋亡基因bcl-2的表达,增强caspase8活性,提高KG-la细胞被活化免疫细胞杀伤的敏感性。5.白藜芦醇和姜黄素能阻止KG-1a细胞通过外源性凋亡途径诱导活化免疫细胞凋亡。