U-box型泛素连接酶在植物抗逆和生长发育等过程中发挥着关键的作用。前期,本课题组构建了山葡萄’左山一’叶片的低温差减文库。本研究对文库中一个高表达的新基因进行了克隆,并采用分子生物学的实验手段对该基因的功能进行了研究,以期为揭示葡萄抗逆机制和开展抗性育种工作提供新的理论依据。根据序列分析结果,该基因编码的蛋白具有U-box功能域,因此命名为PUB(Plant U-box Protein)。多序列比对结果表明,山葡萄VaPUB与多个物种中的U-box泛素连接酶和病原菌快速响应蛋白CMPG1具有很高的氨基酸序列相似性。利用荧光定量PCR分析基因表达模式,发现PUB在山葡萄’左山一’根、茎、茎尖、叶中均稳定表达。PUB的表达受到低温、霜霉菌、SA、ABA的显著调控,但在不同葡萄品种中的表达趋势不同。对PUB启动子区域进行扩增,发现不同葡萄品种间存在单核苷酸突变,这说明基因在不同葡萄品种中的转录调控模式可能存在差异。本研究采用农杆菌介导的花絮浸沾法,获得了过表达VaPUB的转基因拟南芥株系。研究发现,过表达VaPUB显著提高了拟南芥的抗寒性和耐盐性,但是对拟南芥的根系生长、抗旱性、和对霜霉病的抗性没有显著的影响。对冷诱导相关基因的表达进行检测,发现过表达VaPUB显著提高了 ICE-CBF 通路正调控基因CBF1/DREB1B、CBF3/DREBIA、COR15A、KIN1 和 SuSy 的表达水平,抑制了CBF2/DREB1 和MYB15的表达。为了更深入、直接的研究VaPUB在葡萄中的生物学功能,该基因被转入Vitis vinifera’Thompson Seedless’。研究发现,转基因葡萄叶片气孔开合程度变大,叶片上表皮层变薄,栅栏细胞不规则且松散排列,海绵层空隙变宽,并且叶片总叶绿素的含量显著减少。霜霉菌接种实验表明,霜霉菌在转基因叶片上生长更快。采用双向凝胶电泳检测差异蛋白表达,发现转基因叶片中39个蛋白的积累发生了显著改变,这包括抗性蛋白PR10、几丁质酶,碳代谢相关蛋白,氧化反应相关蛋白和蛋白质代谢相关蛋白。亚细胞定位结果表明,VaPUB定位于细胞核。此外,本研究采用了 Microvine葡萄转基因体系,Microvine具有矮化和短周期内获得果实的特点。VaPUB转基因Microvine株系的获得为开展基因在果实中的研究工作打下了重要的基础。