研究背景卵巢癌是死亡率居首位的女性生殖道恶性肿瘤。经过规范的理想肿瘤细胞减灭术，辅助铂类/紫杉醇为基础的化疗，仍有70%的患者面临复发或疾病进展，晚期患者的5年生存率不足40%.肿瘤细胞对于化疗药物产生耐药性是影响患者预后的重要因素。研究卵巢癌铂类耐药的机制以及对铂类耐药进行预测，对于指导患者的个体化治疗和改善卵巢癌的预后具有重要意义。本课题组自2003年开始致力于卵巢癌铂类耐药相关标记蛋白的研究。运用比较蛋白质组学技术筛选出铂类耐药相关蛋白anneixn A3,并对其进行了深入的研究。动物实验中发现，annexin A3高表达细胞在顺铂作用后裸鼠中成瘤率明显上升；在体外研究中，运用质粒转染技术上调annexin A3的表达后，发现annexin A3能够降低细胞内铂含量及铂一DNA结合量，annexin A3高表达的细胞对铂类的耐药性显著增强；在卵巢癌细胞培养上清和和卵巢癌患者血清中可检测到annexin A3蛋白的存在。进一步研究发现annexin A3通过外泌小体exosome的形式外分泌，并在外分泌过程中携带细胞内的铂流出从而使细胞对铂类耐药性增强。基于以上的研究结果，本研究侧重基础研究到临床应用的转化。前瞻性的检测卵巢癌患者肿瘤组织及外周血中annexin A3蛋白的表达，研究不同表达水平与患者铂类耐药和预后的关系。同时对影响annexin A3表达和铂类耐药的可能机制进行初步探索。方法1、前瞻性连续收集2009年9月至2010年4月期间在北京协和医院行手术、术后辅助铂类为基础化疗的初治上皮性卵巢癌患者，详细记录相关的临床资料。收集患者肿瘤组织，同时顺序收集患者治疗过程中的外周血，用于检测annexin A3蛋白的表达。随访患者的无进展生存期和对铂类药物反应性。2、采用免疫组织化学染色方法检测卵巢癌肿瘤组织中annexin A3蛋白的表达水平。通过组间比较及Logistic回归方法分析不同表达水平对铂类耐药的影响；生存分析检验annexin A3蛋白的不同表达水平对患者无进展生存期的影响。3、运用ELISA方法检测卵巢癌患者外周血中annexin A3蛋白的表达。观察治疗过程中外周血annexin A3的动态变化趋势，卵巢癌肿瘤组织中annexin A3蛋白的表达与外周血中该蛋白表达的相关性，以及铂类化疗的敏感与耐药患者血清中annexin A3表达的差别。4、采用手工显微切割方法纯化肿瘤组织，运用甲基化特异性PCR (MSP)方法研究annexin A3基因启动子区域甲基化状态。比较肿瘤组织中annexin A3低表达和高表达组患者甲基化水平有无差异，铂类耐药和铂类敏感患者甲基化水平有无差异，探索启动子区域DNA甲基化对annexin A3蛋白表达和铂类耐药的影响。结果1、自2009年9月至2010年4月期间共纳入初治卵巢上皮癌患者53例，中位随访时间为15个月（范围4.4-20.2月）。4例患者失访；17名患者疾病进展，其中5名患者死亡。铂类敏感患者38 (77.6%)名，铂类耐药患者11 (22.4%）名。2、经免疫组织化学染色的51例肿瘤标本中，阴性表达者13 (25.5%）例，弱阳性者为12 (23.5%)例，中等阳性者为13 (25.5%)例，强阳性者为13 (25.5%)例。将阴性和弱阳性定义为低表达，中等阳性和强阳性为高表达。经过统计学分析，annexin A3的表达水平和病理类型、分化程度、手术病理分期均无相关性(P值分别为0.499、0.610、0.703)。除外失访患者，25例低表达患者中仅1(4%)例铂类耐药，22例高表达患者中10 (45.4%)例耐药，两组统计学差异明显(P=0.001)Logistic回归分析显示高表达与低表达相比明显增加铂类耐药的风险，其OR=27.6(95可信区间为2.3-327.3)。生存分析显示高表达组较低表达组的PFS明显缩短，平均无进展生存期分别为13.9±1.3月和18.2±0.8月(P=0.01)。经多因素COX风险回归分析，annexin A3表达明显影响患者无进展生存期，其RR=3.219 (95%CI 1.126-9.206)。3、健康女性和卵巢癌患者血清中均可检测到annexin A3的表达。卵巢癌患者化疗前浓度明显高于健康女性(P<0.001)，浓度分别为0.325ng/ml (0.157-1.25ng/ml)和0.187ng/ml(0.058-0.323ng/ml)。肿瘤组织中高表达组患者化疗前外周血中annexin A3浓度高于低表达组，浓度分别为0.373ng/ml (0.157-1.25 ng/ml)和0.298ng/ml (0.174-0.576 ng/ml);肿瘤组织中阳性表达组外周血表达水平也高于阴性组，浓度分别为0.367 ng/ml (0.157-1.25 ng/ml)和0.273ng/ml (0.174-0.576 ng/ml)。但由于样本量小均未达统计学差异水平(P值为0.316和0.125)。卵巢癌患者化疗前、化疗中和化疗后浓度分别为0.325ng/ml(0.157-1.25ng/ml)、0.178 ng/ml (0.014-0.327 ng/ml)和0.141 ng/ml (0.016-0.40 ng/ml),化疗中和化疗后浓度明显降低(P<0.001)。疾病进展后表达再次上升为0.250 ng/ml (0.127-0.40 ng/ml),明显高于化疗中和化疗后(P=0.001)。铂类敏感组具有相似的趋势。而铂类耐药组化疗中的浓度为0.148ng/ml (0.064-0.285ng/ml),停止化疗后升高至0.188ng/ml (0.028-0.337 ng/ml)。外周血中annexin A3蛋白的表达与CA125有正相关性，Pearson检验相关系数为0.312, P<0.001。CA125>35U/ml组样本annexin A3的浓度为0.270ng/ml(0.191-1.057ng/ml)显著高于CA125<35U/ml组的0.171 ng/ml (0.094-0.233ng/ml), P<0.001。4、运用MSPPrimer分析软件，发现在annexin A3基因启动子区域存在甲基化位点。卵巢癌细胞系和肿瘤组织中annexin A3基因启动子区域甲基化位点均为甲基化和未甲基化的混合状态。患者肿瘤组织甲基化的中位水平为33.3%(5.1%-86.5%)。肿瘤组织annexin A3高表达组和低表达组患者的甲基化程度分别为37.5%(6.1%-73.7%)和27.2% (5.1%-86.5%)，两组无统计学差异(P=0.559)。铂类敏感和耐药患者的中位甲基化程度分别为31.7%(6.1%-79.3%)和38%(5.1%-64.1%)，两组也无统计学差异(P=0.86)。结论1、卵巢癌肿瘤组织中annexin A3蛋白的表达水平与患者的铂类耐药及预后密切相关。高表达组铂类耐药风险明显高于低表达组患者。肿瘤组织中annexin A3表达水平影响患者的预后，高表达组患者的无进展生存期较低表达组明显缩短。提示肿瘤组织中annexin A3蛋白的表达可能成为预测患者铂类耐药和影响预后的重要标志物。2、卵巢癌患者和健康女性外周血中均可检测到annexin A3蛋白的表达，化疗前卵巢癌患者外周血中annexin A3蛋白的表达水平远高于健康女性。肿瘤组织中annexin A3高表达者，外周血中annexin A3的测定值亦有升高，但现有的样本数尚未达到统计学差异。化疗可以使外周血中annexin A3的浓度明显进行下降。化疗结束后，铂类敏感组的annexin A3测定值仍能进一步降低，而铂类耐药组的该数值不降反升。疾病进展时annexin A3明显升高。外周血中annexin A3的表达和CA125有正相关性，CA125>35 U/ml的样本中annexin A3的浓度高于CA125<35 U/ml的样本。上述结果对于继续探讨annexin A3成为预测卵巢癌铂类耐药标记蛋白具有积极意义。有待建立和开发更为稳定和敏感的、在外周血中检测annexin A3蛋白的方法和试剂盒。3、首次对annexin A3基因启动子区域甲基化状态进行了研究，发现启动子区域存在甲基化的潜在位点，并且发现肿瘤组织和卵巢癌细胞系中annexin A3基因启动子区域甲基化位点均为甲基化与非甲基化的混合状态。本研究未发现肿瘤组织annexin A3基因启动子区域甲基化水平对annexin A3蛋白的表达和铂类耐药有明显的影响，还需对其它可能的影响机制进行研究。