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研究背景：恶性肿瘤已经成为危害人类健康的常见疾病，在人类死亡病因中，癌症位居第一，并且其发病率仍在上升。在诸多癌症中，乳腺癌的发病率和死亡率也在逐年递增，目前全世界每年约有120万女性罹患乳腺癌。我国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一，近年来我国乳腺癌发病率正以约每年3％的速度递增，并且主要集中于大中城市，发病年龄呈年轻化的趋势。如何有效的预防和治疗乳腺癌，成为医学界关注的重要课题之一。1985年Coussens等发现并提出了人表皮生长因子受体2基因（humanepidermal growth factor receptor 2，HER-2／neu，c-erbB-2），HER-2是一种被高度调控的酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinades，RTKs），属于人表皮生长因子受体家族（epidermal growth factor receptor，EGFR）中的一个重要成员。流行病学调查发现：作为肿瘤发生的癌基因，HER-2在25％～30％的乳腺癌中过表达。大量研究已经证明，HER-2过表达与乳腺癌的发生、发展、转移及不良预后密切相关。如何有效地抑制乳腺癌患者HER-2的过表达，已经成为乳腺癌研究领域中的热点。RNAi（RNA interference）即RNA干扰技术，是一种可靠的阻止或抑制基因表达的方法，是指一些小的双链RNA（small interfering RNA，siRNA）可以特异、高效地阻断体内特定基因的表达，促使其mRNA降解，诱导细胞表达出特定基因低表达或缺失的表型，由于这是一种在RNA水平的基因表达抑制，故称为RNA干扰。由于RNAi提供了一种特异性基因功能失活的方法，可以作为一种简单有效的替代基因敲除的工具，它在功能基因组学研究、基因治疗等领域越来越得到更多的重视。本研究选择HER-2过表达的乳腺癌BT-474细胞株为研究对象，应用RNAi技术沉默该BT-474细胞中的HER-2基因，观察其抗癌的作用，并对其作用机制进行了初步探讨。研究目的：设计并构建针对HER-2 mRNA的特异性RNA干扰质粒载体，建立稳定转染的细胞株，通过体外和体内实验研究特异性HER-2 siRNA对BT-474细胞HER-2的干扰作用，及其对BT-474细胞的抑制作用，为RNAi技术用于防治乳腺癌提供基础的实验依据。研究方法：1．根据人HER-2 mRNA基因编码区序列，设计并合成针对HER-2的3条小发夹RNA（shRNA）模板脱氧寡核苷酸序列（siRNA-1、siRNA-2及siRNA-3）和1条作为负对照的无关序列（siRNA-neg）。利用pRNAT-U6.1／Neo载体质粒构建了3种特异性HER-2 siRNA质粒（pRNAT-U6.1／Neo-siRNA-1、pRNAT-U6.1／Neo-siRNA-2及pRNAT-U6.1／Neo-siRNA-3）和1种无关序列质粒pRNAT-U6.1／Neo-siRNA-neg。2．通过阳性克隆PCR鉴定及DNA测序鉴定来验证构建的重组质粒是否符合实验要求。3．在阳离子脂质体介导下，用重组质粒转染HER-2过表达的人乳腺癌BT-474细胞株，筛选出阳性稳定转染重组质粒的细胞进行克隆，分别采用RT-PCR和Western blot技术检测HER-2 mRNA和HER-2蛋白表达的变化，用MTT比色法和平板克隆形成试验检测细胞增殖活性，采用流式细胞仪测定细胞周期变化和细胞凋亡情况，采用运动小室实验检测细胞的运动侵袭能力。4．用稳定转染重组质粒的BT-474细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，接种后第30d处死裸鼠并剥离瘤体，称量瘤体重量并计算抑瘤率，采用RT-PCR检测HER-2基因水平，采用Western blot技术测定肿瘤组织的HER-2蛋白水平。研究结果：1．特异性HER-2 siRNA表达载体的构建及鉴定构建pRNAT-U6.1／Neo-shRNA-HER-2重组质粒的阳性克隆PCR鉴定显示siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3及siRNA-neg的目的片段均已成功地克隆入pRNAT-U6.1／Neo载体。重组质粒的DNA测序鉴定结果显示，siRNA-1、siRNA-2及siRNA-neg在碱基序列、长度插入方向上与实验设计完全一致，符合实验设计要求，而siRNA-3未能成功通过DNA测序鉴定。2．特异性HER-2 siRNA对乳腺癌BT-474细胞抑制作用的体外实验研究2．1在阳离子脂质体介导下，用重组质粒转染HER-2过表达的人乳腺癌BT-474细胞株，成功筛选出阳性稳定转染重组质粒的细胞株。2．2 RT-PCR方法检测结果：siRNA-1组和siRNA-2组BT-474细胞HER-2 mRNA水平与阴性对照组相比显著降低（P＜0.05），抑制率分别达到61.04％和41.05％，而无关序列siRNA-neg组HER-2 mRNA水平与阴性对照组比较无显著下降。2．3 Western blot方法检测结果：siRNA-1组和siRNA-2组的HER-2蛋白水平与阴性对照组相比显著降低（P＜0.05），抑制率分别达到59.34％和38.01％，空质粒组和负对照组HER-2蛋白水平略有下降，但其HER-2蛋白抑制率和阴性对照组之间无显著性差异。2．4 MTT法测定结果显示siRNA-1组与阴性对照组相比能显著地抑制BT-474细胞增殖（P＜0.05），而siRNA-neg对BT-474细胞增殖的影响与阴性对照组相比无显著性差异。2．5流式细胞术检测实验各组细胞周期显示：与阴性对照组相比siRNA-1组细胞G0／G1期细胞比例显著增多（P＜0.05），S期细胞比例显著减少（P＜0.05）；siRNA-neg组细胞与阴性对照组相比各期均无显著性差异。2．6流式细胞术检测到siRNA-1组BT-474细胞与阴性对照组比较凋亡率显著升高（P＜0.05），而siRNA-neg组与阴性对照组相比凋亡率无显著性差异。2．7平板克隆形成试验显示siRNA-1组细胞在平板中形成克隆数与阴性对照组相比显著减少（P＜0.05）；siRNA-neg组平均克隆形成率与阴性对照组相比无显著性差异。2．8运动小室实验检测细胞侵袭力的情况显示：siRNA-1组通过小室人工基底膜的细胞数与阴性对照组相比显著减少（P＜0.05）；siRNA-neg组与阴性对照组相比无显著性差异。3．特异性HER-2 siRNA对乳腺癌BT-474细胞抑制作用的体内实验研究3．1成功建立裸鼠皮下移植瘤模型，实验各组成瘤率为100％。3．2测量皮下移植瘤体积并绘出肿瘤生长曲线，结果显示：siRNA-1组肿瘤生长速度显著低于阴性对照组（P＜0.05），而siRNA-neg组与阴性对照组相比无显著性差异。3．3称取瘤体重量发现：siRNA-1组瘤重与阴性对照组比较显著减轻（P＜0.05），抑瘤率达到51.61％，而siRNA-neg组瘤重与阴性对照组相比无显著性差异。3．4 Western blot检测结果表明siRNA-1可将皮下荷瘤裸鼠肿瘤组织中HER-2蛋白水平显著下调（P＜0.05），其抑制率达到50.64％，而siRNA-neg组与阴性对照组相比HER-2蛋白水平无显著性差异。3．5 RT-PCR检测结果表明siRNA-1可将皮下荷瘤裸鼠肿瘤组织中HER-2 mRNA水平显著下调（P＜0.05），其抑制率达到54.69％，而siRNA-neg组与阴性对照组相比HER-2 mRNA水平无显著性差异。初步结论：1．利用pRNAT-U6.1／Neo质粒成功设计并构建了针对HER-2 mRNA的特异性RNA干扰质粒载体。2．建立了稳定转染pRNAT-U6.1／Neo-shRNA-HER-2重组质粒的BT-474细胞株。3．在体外实验中证明了pRNAT-U6.1／Neo-shRNA-HER-2能特异性下调BT-474细胞中HER-2基因水平和蛋白水平，阻滞BT-474细胞于G0／G1期，显著抑制BT-474的生长、增殖和侵袭能力，促进BT-474细胞的凋亡。4．在体内实验中证明了pRNAT-U6.1／Neo-shRNA-HER-2能特异性下调BT-474细胞裸鼠皮下移植瘤中HER-2基因水平和蛋白水平，抑制肿瘤的生长。5．本实验为RNAi治疗乳腺癌提供了一定的实验依据。