膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，大约70％的患者初诊时为浅表性膀胱癌，30％为浸润性膀胱肿瘤。膀胱癌的恶性生物学特性包括：多灶性、多基因参与、多阶段异质性生长。膀胱癌目前的治疗主要包括手术和术后膀胱腔内灌注抗癌药物，然而手术后易复发和对化疗药物的高度耐药性等相关问题一直是基础与临床研究的重点课题，人类也一直在探索更为有效的膀胱癌治疗方法。基因治疗经过近20多年的发展已被认为是继手术、化疗等常规治疗方法之后极有希望根治膀胱癌的方法。但有效的基因治疗靶点及基因治疗方法的选择成为基因治疗应用于临床的最大障碍。RNA干扰(RNA interference，RNAi)的发现为我们快速、准确的研究基因的功能、寻找基因治疗的靶点带来了希望，同时治疗性的基因沉默技术作为一种基因治疗的手段也拥有巨大的潜力。RNAi是一种非常保守的基因沉默机制。在原始生物中RNAi能够保护基因组免受病毒或者其它基因片段的插入，并且在生物的发育过程调节众多基因的表达。短的双链RNA中的反义链与RNA沉默诱导复合物相结合后能够与同源的mRNA序列特异性的结合，导致mRNA切割断裂及随后出现的转录后水平基因表达的抑制。尽管我们现在对RNAi的分子机制及RNAi是如何调节基因表达方面的了解还仅仅是冰山一角，但RNAi为我们提供了治疗肿瘤的新方案及新思路。肿瘤的发生与发展与细胞周期调节失控密切相关。E2F3是细胞周期调控过程中起核心作用的转录因子，其控制着细胞增殖过程(DNA复制及细胞周期调控)中众多基因的表达。E2F3具有很高的转录激活能力，它是细胞周期由静止期进入S期所必需的转录因子。E2F3与视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein，pRB)关系密切，在人类的众多肿瘤中都存在Rb基因的失活，而具有生长抑制特点的pRB的主要功能就是通过对E2F的调节而起作用的。为了探索E2F3在细胞周期调控过程中是否起关键作用，其是否可以作为膀胱癌基因治疗的新靶点，应用RNAi的方法以E2f3基因为基因治疗的靶点进行膀胱癌基因治疗能否有效的抑制肿瘤细胞的增殖?为了科学的回答上述问题，本文进行了以下实验研究：①研究膀胱癌不同分级组织中的E2F3及其相关调控蛋白的表达；分析E2F3在膀胱癌发生与发展中的作用；②应用RNAi技术研究人膀胱癌细胞株5637、T24转染针对E2F3基因的重组干扰质粒后E2F3基因转录水平和E2F3蛋白表达的变化；观察siRNA对5637、T24细胞细胞周期、凋亡及增殖的影响；③研究重组干扰质粒对膀胱癌裸鼠移植瘤模型的治疗效果，为膀胱癌基因治疗提供新的治疗靶点和新的理论依据。第一部分膀胱移行癌组织中E2F3、C-myc及Bcl-2的表达及其与膀胱癌的关系目的：本部分探讨膀胱移行细胞癌(Bladder transitional cell carcinoma，BTCC)组织及正常膀胱粘膜组织中E2F3基因及其下游相关基因C-myc和Bcl-2的表达情况，同时分析E2F3、C-myc和Bcl-2的表达与临床病理参数之间的关系及三个指标之间的相关性，初步揭示BTCC发生、发展的分子机制，为后续的以E2f3基因为靶点的基因治疗体外、体内实验研究奠定理论基础。方法：应用免疫组织化学方法检测不同病理分期及组织分级的BTCC标本和正常膀胱粘膜中E2F3、C-myc与Bcl-2蛋白的表达情况，应用免疫组化自动分析系统进行分析，结果以积分光密度(integrated optical density，IOD)表示；应用RT-PCR的方法半定量分析E2F3 mRNA在不同组织中的表达情况，探讨BTCC组织中E2F3、C-myc与Bcl-2蛋白的表达之间的关系及三者与临床病理参数之间的关系。结果：免疫组织化学结果显示，E2F3表达阳性率在膀胱移行细胞癌中为32.8％，而正常膀胱粘膜组织E2F3无表达，两组间差异有显著性(P＜0.05)，且E2F3的表达率与膀胱癌的分级和分期密切相关(P＜0.01)。C-myc在移行细胞癌组及正常膀胱黏膜中的表达率分别为60.9％和0(P＜0.01)，Bcl-2在移行细胞癌组及正常膀胱黏膜中的表达率分别为79.6％和10％(P＜0.01)。在膀胱移行细胞癌中C-myc表达与病理分级、组织分期有关(P＜0.01)，Bcl-2的表达率只与病理分级密切相关(P＜0.01)。免疫组织化学结果经过软件分析后显示，BTCC组织中E2F3表达的IOD值为65698±32275，正常膀胱粘膜组织E2F3无表达，两组间差异有显著性意义(P＜0.01)，且E2F3的表达与膀胱癌的分级密切相关(P＜0.01)。C-myc在癌组织与正常组织中的IOD分别为62855±19007和0(P＜0.01)。Bcl-2在BTCC及正常粘膜中的IOD分别为67331±34287和15487，差异有统计学意义(P＜0.01)。C-myc蛋白与膀胱移行细胞癌的病理分级密切相关；C-myc蛋白在浸润性BTCC中的阳性表达情况明显高于表浅性BTCC，二者间差异有显著性(P＜0.01)；Bcl-2表达阳性率G3明显高于G1和G2(P＜0.01)，但与分期无关(P＞0.05)。在RT-PCR结果中，40例肿瘤组织中均有E2F3 mRNA表达，10例正常粘膜中E2F3 mRNA呈阴性表达，两组间的差异具有统计学意义(P＜0.01)。结论：E2F3与膀胱癌的恶性程度密切相关，其不仅是膀胱癌的诊断与预后指标，而且为膀胱癌的基因靶向治疗提供理论依据。E2F3与靶基因c-myc和bcl-2的表达密切相关，E2F3可能通过与C-myc及Bcl-2协同作用共同参与了膀胱移行细胞癌的发生、发展。第二部分应用RNAi沉默E2F3基因对人膀胱癌细胞株生长抑制的体外实验研究目的：本文第一部分实验证实膀胱移行细胞癌中E2F3的表达异常增高。本部分试图通过RNA干扰来观察E2F3基因沉默对膀胱癌细胞株生长的影响，以确定以E2F3为靶点、应用RNAi技术进行膀胱癌基因治疗的效果。方法：首先设计合成三对针对于E2F3基因的siRNA对应模版DNA序列，经过退火处理后克隆至线性pRNAT-U6.1／Neo质粒中，构建重组质粒pRNAT-siE2F3。经过酶切、PCR及测序验证后将三种pRNA-siE2F3转染入人膀胱癌5637、T24细胞株中。通过RT-PCR方法筛选出最为有效的干扰片段。采用Western blot、免疫细胞化学技术检测干扰前后蛋白水平E2F3表达的变化，应用MTT及细胞克隆形成实验检测细胞增殖情况，应用流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期变化情况。结果：通过限制性内切酶酶切、PCR及测序三种方法的验证，成功的构建了能够表达针对E2F3基因的干扰质粒。质粒经过去内毒素提取后，在脂质体2000的帮助下能够高效的转染5637及T24细胞，转染后12小时即可观察到绿色荧光的表达，转染后24小时绿色荧光的表达达到最大值，并且在转染后48h和72h绿色荧光的表达无明显减弱。重组质粒转染48h后与PBS对照组相比能够明显降低5637及T24细胞中E2F3 mRNA的水平，结果显示5637细胞中三个重组质粒组E2F3基因与GAPDH基因光密度的比值与PBS组相比分别下降了(72.91±9.67)％、(69.75±13.61)％、(75.24±11.33)％(P＜0.01)；T24细胞中也出现相似的结果，三个重组质粒组E2F3基因与GAPDH基因光密度的比值与PBS对照组相比分别下降了(65.4±7.76)％、(59±5.73)％、(33.6±1.72)％(P＜0.01)。经过筛选的pRNA-siE2F3-1干扰载体可以在蛋白质水平抑制E2F3的表达。重组质粒转染细胞48 h后用E2F3单克隆抗体进行免疫细胞化学染色，结果显示，转染重组质粒的5637及T24细胞E2F3的表达明显减少。进一步的研究显示重组质粒能显著性的抑制5637及T24细胞增殖，抑制率分别为(46.15±5.06)％和(43.12±5.94)％。同时，重组质粒能够促进细胞的凋亡，使进入S期的肿瘤细胞数量显著降低，细胞周期受到阻滞。结论：重组质粒在脂质体2000的帮助下能够高效的转染5637及T24细胞，并且细胞内的siRNA能够高效、特异的下调E2F3基因的表达；重组干扰质粒通过阻滞细胞周期的进展，抑制了细胞的增殖，并导致细胞发生凋亡。上述实验表明E2F3基因可以作为膀胱癌基因治疗的高效靶点，这也为后续的以E2F3为靶点的膀胱癌基因治疗体内实验奠定基础。第三部分以质粒为干扰载体的E2F3基因沉默对荷瘤裸鼠的体内抑瘤实验研究目的：本部分应用膀胱癌细胞系5637细胞复制膀胱癌的裸鼠移植瘤模型，并观察重组质粒pRNA-siE2F3对裸鼠移植瘤组织内E2F3表达的影响及对肿瘤的生长抑制作用，为其临床开发应用和探索肿瘤治疗的新途径提供实验和理论基础。方法：5-6周裸鼠在恒温(25-27℃)、恒湿(25％-50％)和无特殊病原菌条件下饲养。以膀胱癌细胞株5637细胞悬液(2×10~6)构建裸鼠人膀胱癌移植瘤动物模型，并计算成瘤率。根据组别的不同，分别给予PBS、空质粒脂质体混合液及重组干扰质粒脂质体混合液进行肿瘤局部多点注射治疗。治疗过程中测量肿瘤体积，计算肿瘤抑制率，并观察各组治疗后肿瘤生长情况，并绘制肿瘤生长曲线。治疗完成后7天处死裸鼠，剥离瘤体组织进行称重；应用免疫组织化学染色法观察各组中E2F3蛋白及Bcl-2蛋白的表达情况；应用RT-PCR及Western blot方法观察E2F3在mRNA及蛋白质水平表达的情况。结果：成功地构建了裸鼠人膀胱癌5637细胞株的动物模型，5637细胞成瘤率为87.5％(21／24)。使用重组质粒pRNA-siE2F3-1 15天后，PBS组、空质粒组及重组质粒组移植瘤体积(mm~3)分别为999.81±57.69、1027.79±122.41、129.42±32.65，重组质粒组与PBS对照组差异显著(P＜0.01)。肿瘤瘤体称重的结果显示PBS对照组、空质粒对照组及pRNA-siE2F3组裸鼠的瘤体重量依次为1.96±0.25g、1.99±0.14g、0.24±0.04g，这也表明pRNA-siE2F3可显著抑制肿瘤生长，而统计学检验结果表明PBS对照组、空质粒对照组裸鼠瘤体重量之间无显著性差异(P＞0.05)。E2F3及Bcl-2免疫组织化学结果显示：瘤体内的E2F3 IOD值由PBS对照组的210790±14405降至pRNA-siE2F3实验组的38955±7439(P＜0.01)，说明组质粒pRNA-siE2F3能抑制肿瘤细胞的E2F3的表达，抑制膀胱癌5637细胞的生长；同时，瘤体内的Bcl-2表达率也出现明显下降，由PBS对照组的98633±12248降至pRNA-siE2F3实验组的30094±9886(P＜0.01)。RT-PCR和Western Blot结果表明与PBS对照组相比，pRNAT-siE2F3-1可显著降低瘤体中E2F3在mRNA及蛋白水平的表达，表达率分别下降了(87.09±1.31)％和(87.88±2.35)％(P＜0.01)。PBS对照组与空质粒对照组在各项指标测量中都无明显差异(P＞0.05)。结论：重组质粒pRNA-siE2F3能有效抑制裸鼠人膀胱癌5637细胞株动物模型肿瘤的生长并降低了瘤体内E2F3及Bcl-2的表达。本研究为以E2F3为靶点的肿瘤基因沉默疗法提供了可靠的理论和实验基础。