一、降糖消渴颗粒活血化瘀组分对高脂饮食诱导肥胖C57BL/6J小鼠糖脂代谢的影响目的本研究采用高脂饲料诱导的C57BL/6J肥胖小鼠模型,观察降糖消渴颗粒活血化瘀组分丹酚酸B、姜黄素对肥胖及肥胖相关的糖脂代谢异常的影响;并通过对肥胖C57BL/6J小鼠脂肪组织中脂肪分解及成脂分化关键转录因子指标的检测,进一步探讨降糖消渴颗粒活血化瘀组分在调控脂肪组织功能,改善机体糖脂代谢方面的可能作用机制。方法6周龄C57BL/6J雄性小鼠,共70只,按体重随机分为正常对照组(n=10)及高脂组(n=60),正常对照组小鼠喂饲普通全价饲料,高脂组(HFD)小鼠喂饲纯化高脂饲料。12周后,以体重超过正常饲料组平均体重的20%为肥胖模型.成功标准,将造模成功的肥胖小鼠按体重随机分为模型组、二甲双胍组、丹酚酸B姐、姜黄素组(n=1 1)。各组按10g.BW/O.1ml体积灌胃给药,丹酚酸B剂量为:100mg/kg.BW/day;姜黄素剂量为:50mg/kg.BW/day;二甲双胍给药量为75mg/kg.BW/day,模型组及正常组灌胃等量去离子水,共给药8周。每周同一时间监测小鼠体重、摄食量、空腹血糖(FBG),在第4、8周测定各组小鼠体脂含量及口服葡萄糖耐量(OGTT)。实验结束后取材,检测血中甘汕三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋内胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(FFA)及肝功能(ALT、AST)相关指标;HE染色观察脂肪组织病理形态学改变;RT-PCR、Western Blot法检测脂肪组织中脂肪分解及成脂分化转录相关因子 ATGL、HSL、β3-AR、CEBPα、PPARα、PPARγ 及 SREBP-1 的 mRNA 及蛋白表达量。结果在体重变化方面,我们发现高脂饮食诱导8周时,HFD组小鼠有29只(48.3%);12周时,HFD组小鼠共有47只肥胖模型成功,成模率达78.3%。治疗8周后,模型组小鼠体重平均增加15.71g;正常组小鼠体重平均增加8.315g;丹酚酸B组小鼠体重平均增加0.987g;姜黄素组小鼠体重平均增加2.07g;而阳性药物二甲双胍组小鼠体重则平均降低了 5.092g。各治疗组与模型组相比,体重增加均明显低于模型组(二甲双胍组、丹酚酸B组P<0.01;姜黄素组P<0.05)。监测各组小鼠体脂率变化发现:在治疗第4周时,模型组小鼠体脂率显著高于正常组(P<0.05),而与模型组相比,各治疗组小鼠体脂率均有所降低,尤以阳性药二甲双胍组小鼠的体脂率较低较为显著,存在统计学差异,而受试药丹酚酸B、姜黄素组小鼠体脂率虽较模型组有所下降,但无统计学差异。在治疗第8周时,与模型组相比,各治疗组小鼠体脂率均显著降低(丹酚酸B、姜黄素组P<0.01,二甲双胍组P<0.001)。各组小鼠摄食量总体呈现上升趋势,丹酚酸B、姜黄素在本研究所用的药物剂量下,均未影响小鼠摄食量。与模型组相比,各治疗组小鼠治疗第2周后血糖开始下降,在第5周时血糖值降幅较大,达到治疗期间最低峰值后又出现走高趋势;而丹酚酸B组至第7、8周时空腹血糖开始逐渐回落,在给药第7、8周时,各治疗组血糖水平较模型组显著降低(P<0.01)。4周时OGTT结果显示,各治疗组曲线下面积(AUC)均小于模型组(P<0.01),尤以二甲双胍组最为显著。8周时OGTT曲线下面积显示,各治疗组AUC小于模型组,统计学差异显著(P<0.01)。给药8周后,各治疗组均降低了肥胖小鼠血清中TG、TC、LDL-C、FFA的含量(P<0.01、P<0.05),而血清HDL-C水平较模型组小鼠有所回升(P<0.01)。经8周治疗后,丹酚酸B、姜黄素组血清ALT、AST水平与模型组相比,均出现不同程度降低,具有统计学差异(P<0.01)。在褐色脂肪组织(BAT)脂解因子的基因表达方面,与模型组相比,二甲双胍显著上调了 Adiponectin、ATGL、β3-AR的mRNA的表达量(P<0.05);丹酚酸B组显著上调了 HSL的mRNA表达(P<0.05)。姜黄素组显著上调了 β3-AR的mRNA表达(P<0.05)。BAT在成脂转录因子的基因表达方面,丹酚酸B、二甲双胍组上调了 C/EBPα、PPARγ的mRNA表达(P<0.05),而姜黄素组虽有上调趋势,但无显著性差异(P>0.05)。各治疗组对BAT中PPARα、SREBP-1 mRNA的表达无明显影响。在白色脂肪组织(WAT)脂解因子的基因表达方面,二甲双胍组中Adiponectin、ATGL及β 3-AR的mRNA的表达量较模型组相比均显著上调(P<0.05),姜黄素组显著上调HSL、β 3-AR的mRNA表达(P<0.05)。丹酚酸B组虽有上调ATGL、HSL及β3-ARmRNA的趋势,但无显著性差异(P>0.05)。在成脂转录因子的基因表达方面,与模型组相比,二甲双胍组、丹酚酸B组均上调了 C/EBPα的mRNA表达,差异有统计学意义(P<0.05),各治疗组均显著上调PPARγ的mRNA表达(丹酚酸B、姜黄素P<0.05;二甲双胍P<0.01)。各治疗组对WAT中PPARα、SREBP-1的mRNA表达较模型组均无明显差异。在BAT中相关脂解蛋白的表达方面,与模型组相比,各治疗组中ATGL蛋白表达量升高,具有显著性差异(P<0.05)。姜黄素组的HSL蛋白表达显著上调P<0.05)。而β3-AR的蛋白表达各组无明显差异。在成脂转录因子的蛋白白表达方面,各治疗组均显著上调了 C/EBPα、PPARγ的蛋白表达(P<0.05)。二甲双胍组、丹酚酸B组显著增加了 PPARα的蛋白表达(P<0.05),而姜黄素组对PPARα的蛋白表达无明显影响。丹酚酸B组显著降低SREBP-1的蛋白表达(P<0.01),而姜黄素组及二甲双胍组虽有降低趋势,但不具有显著性差异(P>0.05)。在WAT中相关脂解蛋白表达方面,与模型组相比,姜黄素组显著上调了 HSL的蛋白表达(P<0.05);各治疗组中ATGL、β 3-AR的蛋白表达方面与模型组相比均无明显差异。在成脂转录因子的蛋白表达方面,与模型组相比,各治疗组均显著下调了PPARy的蛋白表达(P<0.05),各治疗组在C/EBPα的蛋白表达方面,虽有下调趋势,但无统计学差异(P>0.05);此外,丹酚酸B组及二甲双胍组还显著降低了 SREBP-1的蛋白表达(P<0.01)。结论1.降糖消渴颗粒活血化瘀组分丹酚酸B、姜黄素可减轻高脂饮食诱导的肥胖C57BL/6J小鼠的体重及体脂含量,降低血清TG、TC、LDL-C及FFA,升高HDL-C,并可减轻肥胖导致的小鼠肝脏损伤,调节脂代谢,改善脂代谢紊乱。2.降糖消渴颗粒活血化瘀组分丹酚酸B、姜黄素可降低肥胖C57BL/6J小鼠的空腹血糖,提高胰岛素敏感性,减轻肥胖引起的胰岛素抵抗,调节糖代谢,改善糖代谢紊乱。3.丹酚酸B、姜黄素改善肥胖C57BL/6J小鼠糖脂代谢作用机制可能通过调控转录因子CEBPα、PPARy、SREBP-1参与成脂分化;调控HSL、β3-AR参与脂肪分解而发挥作用的。二、降糖消渴颗粒升清活血化瘀组分对3T3-L1前脂肪细胞分化及功能的影响目的本部分实验以不同浓度的丹酚酸B、姜黄素干预3T3-L1脂肪细胞,通过对细胞形态、生长增殖、脂质含量等细胞生物学研究,观察降糖消渴颗粒活血化瘀组分对细胞分化、功能及形态学的影响;采用RT-PCR法检测其对3T3-L1前脂肪细胞脂解及成脂分化转录因子相关mRNA表达的影响,探讨降糖消渴颗粒活血化瘀组分影响脂肪细胞分化和功能的可能作用机制。方法通过细胞细胞增殖与活力检测筛选丹酚酸B、姜黄素的安全给药浓度。将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板,当细胞生长覆盖面积达90%以上时,进行诱导分化,8-12天细胞分化成熟。将分化成熟的3T3-L1脂肪细胞分为正常对照组;丹酚酸B组(50μM、75 μ M、100 μ M);姜黄素组(10 μ M、20 μ M、35 μ M)。空白组给予含有等体积DMSO正常培养基进行均一化对照,每组设4个复孔,药物干预48h。采用比色法测定甘油释放量及葡萄糖消耗量,评价药物干预后3T3-L1细胞分化和脂肪分解水平及葡萄糖消耗量:油红O染色法观测细胞分化及脂滴形态;RT-PCR法检测脂肪细胞中脂肪分解及成脂分化转录相关基因ATGL、HSL、β3-AR、CEBP αα、PPARα、PPAR γ及SREBP-1 的 mRNA 表达。结果在细胞细胞增殖与活力的影响方面,与对照组相比,丹酚酸B在50、75、100 μM浓度时,其抑制作用并无统计学差异,而当浓度≥125 μM时,丹酚酸B对细胞生长抑制作用具有显著差异(P<0.01)。当姜黄素浓度≥50 μM时,姜黄素对细胞生长抑制作用有统计学意义(P<0.01)。并且细胞出现了成片脱落、死亡。丹酚酸B、姜黄素可促进3T3-L1前脂肪细胞的分化,增加脂质堆积。浓度为100μM的丹酚酸B促分化、增加脂质堆积的作用最强,呈现出一定的量效关系。不同浓度姜黄素的量效关系不显著。在葡萄糖消耗方面,给药24h时,50 μM、75 μM丹酚酸可显著增加葡萄糖消耗量(P<0.05),而100 μM浓度的丹酚酸B对葡萄糖消耗的作用不明显。20μM、35μM浓度的姜黄素也可增加葡萄糖消耗量(P<0.05),其中姜黄素的浓度在20 μ M时最为显著(P<0.01)。干预48h时,各浓度的丹酚酸B及姜黄素均可增加葡萄糖消耗量(P<0.05),而50 μ M、75 u M浓度的丹酚酸B和10 μ M浓度的姜黄素对葡萄糖消耗的作用最为显著(P<0.01)。在对3T3-L1脂肪细胞甘油释放量的影响方面,丹酚酸B干预24h时即可显著抑制细胞的甘油释放量,存在统计学差异(P<0.01),而各姜黄素组在干预24h时与空白组未见明显差异。干预48h时,各浓度的丹酚酸及姜黄素均可显著抑制3T3-L1脂肪细胞的甘油释放量,差异具有统计学意义(P<0.01)。在丹酚酸B对脂解因子及成脂分化转录因子mRNA表达方面:与对照组相比,各浓度的丹酚酸B显著下调了 ATGL、HSL的mRNA表达量(P<0.05);高浓度的丹酚酸B显著上调了 C/EBPα的mRNA表达(P<0.05);各浓度的丹酚酸B均明显上调了 PPARγ的mRNA表达(P<0.01)。中、高浓度的丹酚酸B上调了 PPARα的mRNA表达(P<0.05)。在姜黄素对3T3-L1脂肪细胞脂解因子的基因表达方面:与对照组相比,低浓度的姜黄素下调ATGL的表达(P<0.05)。中、高浓度的姜黄素可显著下调HSL的表达(P<0.01)。高浓度的姜黄素显著下调了 C/EBPα的mRNA表达(P<0.05)。中浓度的姜黄素显著上调了 PPARγ的mRNA表达(P<0.05)。各浓度组的姜黄素虽出现上调PPARα mRNA表达的趋势,但无显著性差异。结论1.丹酚酸B、姜黄素可以促进3T3-L1前脂肪细胞分化,增加脂肪细胞对葡萄糖的消耗和利用,改善胰岛素抵抗。2.丹酚酸B、姜黄素通过促进分化进而增强脂肪细胞功能,抑制脂肪细胞TG合成及分解、促进脂肪酸过氧化,减少FFA释放,调节脂质代谢,起到减肥降脂的作用。3.丹酚酸B、姜黄素对3T3-L1前脂肪细胞细胞分化与功能的调节作用,可能通过调控转录因子CEBP α、PPAR γ及PPARα参与成脂分化;调控ATGL、HSL参与脂肪分解而发挥作用。