红头蜈蚣毒素RhTx2调节TRPV1离子通道的作用机制研究

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目的:瞬时受体电位香草酸1型受体离子通道(transient receptor potential vanilloid-1,TRPV1)是痛觉通路中的关键受体,广泛分布在哺乳动物的中枢和外周神经系统,可以被多种物理和化学刺激激活。由于TRPV1在体温调节方面的重要作用,很多小分子抑制剂在临床实验中失败,因其导致患者的体温异常。多肽毒素是研究离子通道的重要工具,还因其高亲和力和高选择性被广泛开发为药物。TRPV1已被证明是几种毒素的靶标。我们从中国红头蜈蚣的毒液中鉴定出了一种多肽毒素,将之命名为red-headed centipede toxin 2(RhTx2),它能够选择性地激活TRPV1,并且可以使通道快速脱敏。在本研究课题中,我们希望通过研究RhTx2的结构和功能特性,为有关TRPV1的调节机制研究和新型镇痛药的开发提供新的思路。方法:1.我们首先利用凝胶色谱(GC)结合反相高效液相色谱(HPLC)从中国红头蜈蚣的毒液中分离纯化出毒素多肽,通过蛋白测序的方法获得其氨基酸序列。2.从生物公司合成纯度95%的线性毒素多肽,利用氧化还原的方法进行多肽的复性折叠,并进一步用HPLC分离纯化后冻干。3.利用电生理实验技术,全细胞结合单通道记录模式,在细胞水平上进行功能验证和结果分析。4.最后,通过Rosetta计算结构生物方法,模拟出多肽在通道上的结合构象和位置,探讨毒素结合和脱敏的结构机制。结果:1.我们从中国红头蜈蚣的棘突中鉴定出一种31个氨基酸的毒素多肽,分子内两对二硫键,分子量3458.8 D,命名为red-headed centipede toxin 2(RhTx2),是之前发现的RhTx的一个变种。2.结构模拟显示,RhTx2有更大的正电性表面,“首尾”氨基酸形成氢键增加蛋白稳定性。3.RhTx2能够选择性激活TRPV1通道并快速脱敏,且脱敏较为彻底,不易恢复。4.RhTx2作用位置在胞外,且不能被辣椒平抑制。5.RhTx2的激活曲线较RhTx明显右移,EC50升高近100倍。6.单通道记录表明,RhTx2导致的TRPV1的电流脱敏涉及两种机制:同时降低通道的开放概率和单通道电导。7.分子对接实验表明,RhTx2在TRPV1上的结合位置随着通道的开放有所改变,通道处于关闭状态时结合在外孔区的边缘,当通道开放时移至选择性滤器中心。结论:我们的研究结果表明,RhTx2和TRPV1的相互作用是一种独特的作用机制。RhTx2不仅是研究TRPV1通道激活和脱敏机制的工具,也为研究以TRPV1为镇痛靶点的新型痛药物提供了思路。意义:在本研究中,我们从中国红头蜈蚣的毒液中发现了一种多肽毒素RhTx2,它快速激活和快速脱敏TRPV1的性质对于研究TRPV1的激活和脱敏机制起到了积极作用。此外,TRPV1离子通道是对多种疼痛刺激响应的多模态受体,是研究镇痛药的经典靶点。然而,由于TRPV1在体温调节中起关键作用,一些该通道的小分子抑制剂在临床试验中失败,因为它们常常会导致严重的副作用,如改变患者的体温和热感觉,使体温异常升高。因此,为了开发以TRPV1为靶点的新型镇痛药,需要有除抑制TRPV1活性之外的替代策略。我们的多肽毒素RhTx2可以快速脱敏TRPV1,有望在未来的动物模型中探究RhTx2是否具有镇痛作用。
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