背景癫痫是一组由不同病因所引起,脑部神经元高度同步化,且常具自限性的异常放电所导致,以发作性、短暂性、重复性及通常为刻板性的中枢神经系统功能失常为特征的综合征。发作性指癫痫突然发生,持续一段时间后迅速恢复,间歇期正常；短暂性指患者发作持续的时间都非常短,数秒钟、数分钟或数十分钟,处癫痫持续状态外,很少超过半小时；重复性指癫痫都有反复发作的特征,仅发作一次不能诊断为癫痫；刻板性指每种类型发作的临床表现几乎一致。由于其临床发作具有发作性、短暂性、重复性的特点,长期反复发作可致智能低下、精神迟滞、甚则痴呆。癫痫的患病率各国和地区不一。1997年WHO统计报告显示,癫痫的患病率在发达国家、经济转轨国家、发展中国家和不发达国家分别为5.0‰、6.1‰、7.2‰、11.2‰,估计全球有约5000万癫痫患者。亚洲国家的患病率在一般在5‰～10‰之间,我国癫痫患病率为7‰,现有癫痫患者900多万人,活动性癫痫(即一年内癫痫发作次数在2次以上者)的患病率为4.6%o,活动性癫痫患者600多万人,同时,我国每年的新发病率25/10万,年新增发患者数为35万人。国内文献报道多数癫痫病人未能得到正规治疗,治疗缺口在34.8%～75%不等,癫痫死亡率为2.42/10～7.82/10万,但真正因癫痫死亡(死于癫痫持续状态)的只占所有死因20%,有40.21%因意外事件死亡,死于自杀者5.51%,不明原因死亡为4.13%。大约70%～80%的患者在医师指导下经正规服用抗癫痫药物(AEDs)和科学规范治疗后可从事正常工作、学习或生活,其中约30%的癫痫患者,临床上常用的抗癫痫药物很难控制其发作,被称为难治性癫痫(Refractory epilepsy, RE)。目前国际上对难治性癫痫尚缺乏统一准确的定义,临床上将经过合理使用多种抗癫痫药物,血药浓度已达到最大耐受剂量,但癫痫发作仍不能得到有效控制者称为难治性癫痫。国内学者提出了较为全面的定义：频繁的癫痫发作,至少每月4次以上；一线抗癫痫药物正规治疗且药物的血药浓度达到有效范围,至少观察2年,仍不能控制发作,影响日常生活；无进行性中枢神经系统疾病或占位性病变。由于难治性癫痫发作频繁,严重影响患者的学习、工作和生活,甚至严重致残,因此研究难治性癫痫发病机制及寻找有效的治疗方法十分重要。与普通癫痫一样,难治性癫痫的发病机制仍不明确,近年来研究发现难治性癫痫患者脑内存在多药转运体的高表达,可能参了难治性癫痫的耐药,研究最深入的是P糖蛋白(P-GP)。这种蛋白是一种膜结合蛋白,属于转运蛋白ATP结合物超家族的成员之一,由MDR1(multidrug resistance1)基因编码,存在于正常人类和哺乳动物有分泌功能的组织和屏障结构中,具有广泛的底物特异性,能与多种结构不同的被动扩散入细胞内的药物和有毒性物质结合,依靠ATP的转化能量将到达细胞内的药物和细胞毒性物质泵出,使P-GP在保护正常组织不受毒素损害的同时,将作用于靶点的药物浓度降低,从而产生耐药性。P-GP抑制剂能显著提高脑内抗癫痫药物浓度,迄今为止已发现数百种MDR逆转剂,这些逆转剂主要可分为7大类：钙通道阻滞剂、环孢霉素类、激素及抗激素类化合物、蛋白激酶抑制剂、钙调素拮抗剂、异喹啉类生物碱及其他等。上述药物均能不同程度的下调P-GP的表达,但由于明显的神经毒性作用,至今尚未批准在人体使用上述药物。因此,如何选择药物是研制耐药蛋白抑制剂作为抗癫痫药物的重点。癫痫属于中医“痫病”范畴,癫痫在理论上从肝论治,《内经》早有记载。癫痫的病机与肝的疏泄失常有关,风痰瘀为肝失疏泄的病理变化。临床研究表明,癫痫从肝论治并运用柴胡疏肝汤治疗难治性癫痫,取得了较好疗效。在此基础逐步筛选出君药柴胡的有效成分柴胡皂苷a(SSa),本课题组前期研究发现SSa具有抑制戊四氮致痫大鼠痫性发作的作用。临床实践中中医药治疗难治性癫痫具有一定的优势,并且发现中药能够增强难治性癫痫对抗癫痫药物的敏感性,降低抗癫痫药物的用量。是否SSa对P-GP及MDR1的表达有一定的抑制作用?是否可以作P糖蛋白的一种阻断剂?本研究以难治性癫痫大鼠模型作为中医药治疗癫痫临床研究的突破口,以多药耐药作为切入点,探讨SSa干预作用的可能机制。目的本研究拟建立锂-匹罗卡品难治性癫痫大鼠模型,观察SSa对癫痫大鼠痫性发作及脑电图痫性波的影响,评价SSa对P-GP及MDR1mRNA表达的影响,探讨SSa在“从肝论治”难治性癫痫中的作用机制,为癫痫的治疗提供实验依据。方法1.氯化锂-盐酸匹罗卡品难治性癫痫模型的建立采用氯化锂-盐酸匹罗卡品的化学点燃方法制作模型。具体如下：SD大鼠首日腹腔注射氯化锂(127mg/kg),18-24h后注射阿托品1mg/kg,30分钟后腹腔注射匹罗卡品(10mg/kg).如未出现癫痫持续腹腔状态,则每隔30min继续腹腔注射匹罗卡品(10mg/kg),直至大鼠出现癫痫持续状态后停止注射。待癫痫持续状态出现60min,腹腔注射10%的水合氯醛(300mg/kg)终止发作。癫痫状态后的大鼠在经过24h的急性期后,进入10-15d左右的潜伏期,每天给予5%糖盐水5m1腹腔注射,2次/d。15d后进入4周慢性期,开始筛选动物,并进行实时视频监测,每笼放5只大鼠,用苦味酸对每只大鼠进行不同标记,连续监测,监测时间8：00-20：00,并及时进行录像的回放、记录,Ⅳ级以上发作为成功的癫痫自发发作模型。未达到Ⅳ级以上发作的弃用。2. SSa对难治性癫痫大鼠痫性发作及脑电图的影响将制备成功的48只SD难治性癫痫大鼠模型随机分为4组,模型组(B)、VPA组(C)、SSa低剂量组(D)、SSa高剂量组(E),每组各12只,另有空白对照组(A)12只。A组和B组每日均予等量生理盐水灌胃,C组每日直接灌胃给药VPA200mg/kg,D组每日腹腔注射SSa1.09mg/kg,E组每日腹腔注射SSa2.18mg/kg,视频记录大鼠慢性期4周,药物治疗4周,8周后痫性发作次数、发作平均时间及发作级别的变化。于8周治疗结束后,以上每组随机各取2只大鼠进行脑电图描记。3.SSa对P-GP及MDR1mRNA的影响各组大鼠给药8周后,将难治性癫痫大鼠模型24只随机分为4组,模型组(B)、丙戊酸钠组(C)、SSa低剂量组(D)、SSa高剂量组(E),每组各6只,另有空白对照组(A)6只,共5组。通过免疫组化法、免疫印记法,荧光定量PCR法检测各组大鼠脑内海马和颞叶P-GP及MDR1mRNA的表达。4.统计学方法数据用SPSS13.0软件或SPSS17.0软件进行统计学分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示。各组治疗前后发作次数、发作平均时间比较,采用重复测量的方差分析；免疫组化、免疫印记、荧光PCR,不同用药组间比较采用单因素方差分析(One-Ways ANOVA),方差齐性多重比较选用LSD-t检验；方差不齐时,用近似方差分析的Welch法,多重比较采用Dunnett T3法检验。多组有序等级资料采用广义估计方程,以P<0.05为有统计学意义。结果1.难治性癫痫大鼠模型的建立在实验过程中,除空白对照组(A)12只外,共对70只大鼠点燃制备难治性癫痫模型。其中5只大鼠反复给予匹罗卡品,始终无法诱发出癫痫持续状态,故弃用,其余65只大鼠在首次或追加匹罗卡品后开始出现痫性发作,并逐步达到癫痫持续状态(Status epilepticus, SE)。在急性期内(24h)内,有9只大鼠因频繁抽搐而死亡。在潜伏期内(2周),因频繁抽搐以及不能自主进食衰竭死亡共8只,多在SE后一周死亡,进入慢性期。剩余48只存活大鼠,根据随机数字表,分为模型组(B)、VPA组(C)、SSa低剂量组(D)、SSa高剂量组(E),每组12只。在慢性期4周,存活的的大鼠均出现自发发作,发作级别从Ⅰ级逐渐发展至V级,无致痫大鼠死亡。2. SSa对难治性癫痫大鼠痫性发作及脑电图的影响2.1SSa对难治性癫痫大鼠治疗前后大鼠痫性发作次数的影响采用重复测量的方差分析结果显示,3个不同时间点大鼠痫性发作次数差异有统计学意义(P<0.05)。各组之间差异有统计学意义(P<0.05),各时间点与分组间差异有统计学意义(P<0.05)；各个时间点方差分析显示：各组用药前,各致痫组大鼠痫性发作差异无统计学意义(P>0.05)。用药前,各致痫组大鼠痫性发作次数差异无统计学意义(P>0.05)。用药4周后,与B组相比,C、E组均能减少大鼠痫性发作的次数,差异有统计学意义(P<0.05), D组与E组差异无统计学意义(P>0.05)；用药8周后,与B组相比,各组均能减少大鼠痫性发作的次数,差异有统计学意义(P<0.05),C、D组与E组差异均有统计学意义(P<0.05)。各组与治疗前相比,除B组(P>0.05)外,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.2SSa对难治性癫痫大鼠治疗前后大鼠痫性发作平均时间的影响采用单因素重复因素测量的方差分析显示,3个时间点大鼠痫性发作平均时间差异有统计学意义(P<0.05),各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。各时间点与分组间差异有统计学意义(P<0.05)。给药前,各致痫组大鼠痫性发作平均时间差异无统计学意义(P>0.05)。用药4周后,与B组相比,C、E组均能减少痫性发作平均时间,差异有统计学意义(P<0.05),D组与E组差异有统计学意义(P<0.05)；用药8周后,与B组相比,C、D、E组均能减少大鼠痫性发作平均时间,差异均有统计学意义(P<0.05),C、D组与E组差异均有统计学意义(P<0.05)。各组与治疗前相比,除B组(P>0.05)外,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.3SSa对难治性癫痫大鼠治疗后大鼠痫性发作级别的影响采用有序资料的广义估计方程分析显示：3个不同时间点大鼠痫性发作等级差异有统计学意义(P<0.05)。各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。组间比较显示,C组、D组与B组相比,差异无统计学意义(P>0.05),E组与B组差异有统计学意义(P<0.05)。疗后4周、疗后8周与疗前4周相比,差异有统计学意义(P<0.05)。2.4SSa对难治性癫痫模型大鼠脑电图的影响A组大鼠皮质及海马脑电图以基础波即α、β波为主,无明显节律性；B组大鼠出现散在性痫波,多为棘波、尖波、棘慢复合波,出现大量痫性放电；C、D、E组均可见到散在的棘波、尖波出现,而以E组出现的最少。表明丙戊酸钠和SSa高、低剂量组均能抑制大鼠的痫性放电,以SSa高剂量组最为明显。2.5SSa对P-GP及MDR1mRNA的影响免疫组化检测IOD值：各组大鼠海马区CA1、DG区和颞叶皮层区,免疫组化检测P-GP蛋白表达的IOD值差异有统计学意义(P<0.05)。组间多重比较,在CA1、DG区,C组中P-GP的IOD值高于B组(P<0.05),A、E组中P-GP的IOD值低于B组(P<0.05)。E组中P-GP的IOD值低于D组(P<0.05)。在颞叶皮层区,C、D、E组中P-GP的IOD值与B组之间相比差异无统计学意义(P>0.05),E组中P-GP的IOD值低于D组(P<0.05)。免疫组化检测阳性细胞数：各组大鼠海马区CA1、DG区和颞叶皮层区,免疫组化检测P-GP蛋白表达的阳性细胞数差异有统计学意义(P<0.05)。组间多重比较,在CA1和DG区区,C组中P-GP的阳性细胞数高于B组(P<0.05),A、E组中P-GP的阳性细胞数低于B组(P<0.05),E组中P-GP的阳性细胞数低于D组(P<0.05),与A组差异无统计学意义(P>0.05)。在颞叶皮层区,C组中P-GP的阳性细胞数高于B组(P<0.05),E组中P-GP的阳性细胞数与A、B、D组差异无统计学意义(P>0.05)。Western blotting法检测P-GP在海马和颞叶皮层的表达：在大鼠海马区,各组P-GP表达的灰度比值差异有统计学意义(P<0.05)。组间多重比较,C组中P-GP的灰度值比值高于B组(P<0.05), A、D、E组中P-GP的灰度值比值低于B组(P<0.05),E组中P-GP的灰度值比值低于D组(P<0.05),但高于A组(P<0.05)。在大鼠颞叶皮层,P-GP表达的灰度比值差异有统计学意义(P<0.05)。C组中P-GP的灰度值比值与B组差异无统计学意义(P>0.05),A、E组中P-GP的灰度值比值低于B组(P<0.05),E组中P-GP的灰度值比值低于D组(P<0.05),与A组差异无统计学意义(P>0.05)。荧光定量PCR法检测MDR1-mRNA表达：各组大鼠海马区,方差分析显示,荧光实时定量PCR检测MDR1-mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。组间多重比较显示,C组中MDR1-mRNA表达高于B组(P<0.05),A组中MDR1-mRNA表达低于B组(P<0.05),D、E组中MDR1-mRNA表达与B组差异无统计学意义(P>0.05),D组中MDR1-mRNA表达与E组差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠脑内颞叶皮质区,方差分析显示,荧光实时定量PCR检测MDR1-mRNA表达有统计学意义(P<0.05)。组间多重比较显示,C组中MDR1-mRNA表达高于B组(P<0.05),A组中MDR1-mRNA表达低于B组(P<0.05),D、E组中MDR1-mRNA表达与B组差异无统计学意义(P>0.05),D组中MDR1-mRNA表达与E组差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.本研究成功建立氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态后慢性难治性癫痫模型,操作相对简单,成功率较高,稳定性较好,为后续实验打下基础。2.SSa有明显的抗癫痫作用,可以减少难治性癫痫模型大鼠痫性发作次数、发作平均时间及发作级别。3.SSa可以下调海马P-GP的表达,无明显下调颞叶皮质P-GP的表达,无明显下调海马和颞叶MDR1mRNA的表达。