我国每年有上千万烧伤病人,其中轻度烧伤的患者尚可通过其深层未受创部分为模板进行皮肤修复,但深度烧伤的病人,汗腺不能通过皮下剩余正常的组织向上进行后期修复,严重影响了烧伤患者的生活质量。因此汗腺细胞应用于组织工程皮肤构建和皮肤损伤修复的研究已成为热点。汗腺细胞生物学特征和汗腺再生研究启步较晚,近年来针对如何有效促进汗腺细胞体外增殖,维持汗腺细胞生物学特征和功能的研究还在探索中。目前国际上用于培养汗腺细胞的培养基分为有血清和无血清两类培养基,但其扩增和传代及培养体系尚不完善。本文旨在比较不同培养基对于维持汗腺细胞生物学特征和增殖能力的基础上,进一步探索血清和音猬基因(Sonic Hedgehog)在汗腺体外培养条件中的作用和机制,进而优化人汗腺细胞体外培养的条件。第一部分血清在人汗腺细胞体外培养条件中的作用和机制目的:比较含血清和无血清培养基对汗腺细胞生物学特征和功能的影响,并探讨血清在汗腺细胞培养基中的作用和机制。方法:利用手术废弃的六指全层皮肤,去除表皮后,在倒置显微镜下分离出汗腺组织,并将其培养在含血清的SG培养基中(DMEM/F12+10%FBS,h EGF,Hydrocortison,Triiodothyronine,Insulin-Transferrin-selenium)。约一周后,待汗腺细胞向外增殖,将增殖的汗腺细胞分别培养在SG培养基,KGM-2培养基(KBM-2,BPE,insulin,hydrocortisone,transferrin,epinephrine,GA-100)和SG:KGM-2为1:1的混合培养基中。通过细胞形态、细胞增殖,Real-time PCR、体外三维培养等检测方法对三种培养基培养的汗腺细胞的生物学特征和功能进行鉴定。结果:(1)汗腺细胞在三种不同培养基中比较性地培养一周后,混合培养基中培养的汗腺细胞呈更高的增殖率及更稳定的细胞形态;(2)Real-time PCR结果显示,混合培养基中培养的汗腺细胞所表达的标志基因(SMA,K77,CEA,K8,K18,EDAR,C-MYC,Klf-4,OCT-4)都高于SG培养基和KGM-2培养基中所培养的汗腺细胞,并经三维培养,能形成类似汗腺腺体的结构;(3)KGM-2培养基培养的细胞高表达K5,K14等角质化细胞标志基因,并能形成成熟的上皮组织。上述研究表明,含血清的培养基有利于汗腺细胞体外增殖和生物学特征的维持,而无血清的KGM-2培养基使汗腺细胞失去其生物学特征和功能的原因是,无血清培养体系中汗腺细胞会快速分化为角质化细胞。结论:本研究建立的混合培养基,不仅能有效提高汗腺细胞体外增殖能力,还能更好地维持汗腺细胞的生物学特征和功能。第二部分Sonic Hedgehog对体外培养汗腺细胞生物学特征和功能的作用目的:探讨音猬基因(Sonic Hedgehog)即Shh在汗腺细胞体外培养中的作用,进一步优化目前的汗腺细胞体外培养体系。方法:利用手术废弃的六指全层皮肤,去除表皮后,在倒置显微镜下分离出汗腺组织,并将其培养在含血清的SG培养基中(DMEM/F12+10%FBS,h EGF,Hydrocortison,Triiodothyronine,Insulin-Transferrin-selenium)。约一周后,待汗腺细胞向外增殖,将增殖的汗腺细胞分别培养在第一部分中的混合培养基和添加Shh因子的混合培养基中。通过细胞形态、细胞增殖、Real-time PCR、体外三维培养等检测方法对两种培养基培养的汗腺细胞的生物学特征和功能进行鉴定。结果:(1)汗腺细胞在两种不同培养基中培养一周后,添加有Shh混合培养基中培养的细胞同样呈汗腺细胞样形态,且其生长速率与未添加Shh的混合培养基相近;(2)Real-time PCR结果显示,添加有Shh混合培养基中培养的汗腺细胞所表达的标志基因(SMA,K77,CEA,K8,K18,EDAR,C-MYC,KLF-4,OCT-4)相比混合培养基所培养的汗腺细胞有显著提高,并与原代汗腺细胞接近;(3)经三维培养,添加有Shh混合培养基中的汗腺细胞形成汗腺样腺体的结构的数量明显多于未添加Shh的混合培养基。结论:在混合培养基中添加Shh可以更有效地维持汗腺细胞的生物学特征和功能,在体外三维组织培养中形成更多的汗腺样结构。总结本研究通过对人汗腺细胞培养基的比较,证明了混合培养基更适用于培养汗腺细胞,其中血清是维持汗腺细胞生物学特征的关键因素。在此基础上,我们在混合培养基中添加了Shh因子,证明了添加Shh因子可以提高汗腺细胞在体外三维培养中形成汗腺样结构的效率,本研究为汗腺细胞在皮肤组织工程及皮肤损伤修复上的研究奠定了基础。