mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）是一种重要的蛋白激酶。它整合多种信号刺激,包括生长因子、营养状况以及能量状况等。mTOR可以形成至少两种功能性复合体,分别称作mTORC1和mTORC2.mTOR调节大量的细胞内生理生化过程,比如翻译,转录,自噬等。在小鼠中全身敲除mTOR具有胚胎致死性,而仅在骨骼肌组织中特异性敲除mTOR的小鼠会出现能导致过早死亡的进行性肌病,同时表现出肌肉萎缩,线粒体功能受损,以及糖原储存量增加等症状。本论文研究的目的是揭示mTOR激酶活性在肌肉完整性和功能中的作用,以及相关的分子机制。肌肉的结构,肌肉量和组成对于机体的运动、代谢和生物个体的存活至关重要。骨骼肌由多种具有不同代谢和功能特性、收缩速率以及疲劳抗性的肌纤维组成。骨骼肌对多种生理（如运动）和病理（如肌病、糖尿病）条件会产生显著的形态和代谢功能上的适应性。这些适应过程包括肌肉肥大、肌肉萎缩、肌细胞再生、肌纤维类型转换以及线粒体生物发生等,这些都展示了肌肉强大的适应性。在哺乳动物中,骨骼肌占到身体重量的40%,负责大约30%的静息代谢。骨骼肌在调节血糖和代谢稳态中起到关键作用,也是在胰岛素刺激调节条件下80%葡萄糖利用的发生场所。此外,骨骼肌是最大的糖原储存器官。骨骼肌肌肉量和完整性对于机体健康非常重要。骨骼肌在机体葡萄糖、氨基酸、脂肪酸代谢中发挥关键作用,这些成分的过度积累会影响正常的代谢状态。骨骼肌代谢和生长受损会引起或者加重许多疾病,如糖尿病、癌症、艾滋病、慢性肾脏病、充血性心力衰竭、外周动脉疾病、风湿性关节炎。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种蛋白激酶,它可以汇集协调多种由生长因子、营养状况及能量状况等介导的多种信号通路。IGF1/Akt/mTOR信号通路是一条主要的肌肉量调节通路,通过调节肌肉肥大和肌肉萎缩来调节肌肉量。重要的是,mTOR通过控制（i）S6K激酶和翻译抑制蛋白4E-BP1调节蛋白合成,（ii）Akt抗肌萎缩功能调节蛋白降解,（iii）自噬,其过度激活或不足都会影响正常的肌肉量,来调节骨骼肌肌肉量。mTOR信号通路活性异常与多种疾病相关,如癌症、代谢紊乱（肥胖、Ⅱ型糖尿病）。目前已经有大量的针对mTOR抑制因子的研究。雷帕霉素在器官移植、心脏病学、肿瘤学研究中有广泛的应用。然而,雷帕霉素及其衍生物由于在维持完全的抑制mTOR活性中存在局限性,这也被可以抑制mTORC1和mTORC2接触反应活性的ATP竞争性激酶抑制因子的研究所证实。但是,我们也需要注意mTOR接触反应活性被完全抑制所造成的对机体的毒性。于此,我们实验室首先构建了骨骼肌中mTOR特异性敲除小鼠mTOR MKO,其骨骼肌mTOR敲除之后导致肌病,表现为肌肉量减少,线粒体生物发生受抑制。mTOR MKO表现出的肌肉萎缩,线粒体生物发生受抑制,糖原含量升高,与RAmKO小鼠（骨骼肌敲除mTORC1的组成亚基Raptor）相一致。因此,鉴于对mTOR抑制因子的大量临床研究以及mTOR所展现出的对维持肌肉量和完整性的重要作用,本研究将对mTOR在生理和分子细胞水平进行深入的研究,以期更加完全的理解mTOR激酶功能,从而促进研发更加有效的治疗手段和减少相关治疗的副作用。在分子水平上,我们实验室分别通过应用可同时激活PPAR α、γ和δ三种受体的药物苯扎贝特（bezafibrate）,以及转基因过表达PGC1 α,证明了 mTORC1通过PPAR-PGC1α调节线粒体活性。然而,这些研究手段并没有抑制进行性、致死性的肌病。同时也发现mTOR通过PKB/Akt调节糖原水平。事实上,mTOR MKO和RAmKO小鼠的PKB/Akt在苏氨酸308位点（Threonine 308）和 丝氨酸473位点（Serine473）的磷酸化水平提高。Akt苏氨酸308位点磷酸化的增加是由于激酶S6K对IRS-1负反馈环的消失,而Akt丝氨酸473位点磷酸化的增加是由于一种区别于mTORC2的激酶的激活作用。尽管mTOR MKO小鼠与RAmKO小鼠的肌肉表型相似,但是mTOR MKO小鼠表现出更加严重的肌肉萎缩特征,包括在糖酵解以及氧化型肌肉中都出现了肌纤维再生/退化。我们实验室发现与RAmKO小鼠相比,mTOR MKO小鼠dystrophin下调,mTOR通过与YY1转录因子与dystrophin启动子结合,以细胞自主性、具有雷帕霉素抗性、raptor和激酶非依赖性的方式调节dystrophin转录;研究证明mTOR主要通过其mTORC1复合体来维持骨骼肌氧化,葡萄糖利用,生长,完整性和功能。mTOR复合体敲除导致Akt以mTOR非依赖性方式激活,此外,突变小鼠中进行性致死的肌病不是由于改变的线粒体活性所致。mTOR介导的生理生化过程受损可能会导致人体肌病,而临床使用mTOR抑制因子可能对肌肉正常功能产生有害的作用。为此,本研究首先繁育了 mTOR MKOKI小鼠,在此基因型的小鼠中,肌肉中内源性mTOR敲除（mTOR MKO）,同时表达FLAG标记的肌肉特异性激酶失活型mTOR（FLAGmTOR MKI）,从而模拟有效的、生物可行性的肌肉mTOR选择性接触抑制剂的作用效应。通过对比研究mTOR MKOKI和mTOR MKO这两种小鼠模型,阐释肌肉mTOR在肌肉蛋白合成、蛋白降解以及自噬调节等过程中的作用。本研究将肌肉特异性敲除mTOR小鼠（HSA-Cre+;mTOR flox）与HSA-FLAGmTOR MKI转基因小鼠进行杂交。值得注意的是HSA-FLAGmTOR MKI小鼠没有表现任何明显的表型。事实上尽管与内源性mTOR蛋白相比,HSA-FLAGmTORMKI小鼠有高水平的rmTOR基因表达,激酶失活型mTOR没有表现为对其底物产生主要的负突变效应。在mTOR MKOKI小鼠中,Cre重组酶以及FLAGmTOR MKI都是由肌肉特异性启动子HSA（Human skeletal actin）所启动。因此,在正在发育的胚胎的分化肌管中肌肉内源性mTOR失活伴随着表达mTOR激酶失活型。同时构建了 mTOR MKOMWT小鼠,其肌肉内源性mTOR敲除,表达FLAG标记的有正常活性的mTOR激酶（FLAGmTOR MWT）。这种小鼠是通过肌肉特异性敲除mTOR小鼠（HSA-Cre+;mTOR flox）与HSA-FLAGmTOR MKOWT小鼠进行杂交获得。以上两组杂交分别得到的小鼠为:（i）25%mTOR flox（Control）,25%mTOR flox;mTOR KI（Transgenic mTOR MKI）,25%HSA-Cre+;mTORflox（mTORMKO）,25%HSA-Cre+;mTORflox;mTOR KI（mTOR MKOKI）.（ii）25%rmTOR flox（Control）,25%mTOR flox;mTOR WT（Transgenic mTOR MWT）,25%HSA-Cre+;mTORflox（mTORMKO）,25%HSA-Cre+;mTORflox;mTOR WT（mTOR MKOWT）.mTOR MKOKI小鼠表现为比mTOR MKO小鼠更为严重的肌病。mTOR MKOWT小鼠的human mTOR WT等位基因补救恢复了小鼠的正常生长、生理功能以及正常的存活预期。mTOR MKOKI小鼠出生时表现正常,但是之后迅速表现出了生长延迟以及在3周龄提早出现肌营养不良,在6～10周龄过早死亡。mTOR MKOKI小鼠在4周龄出现明显的驼背,脊柱畸形,而mTOR MKO小鼠在13周龄才开始出现此症状。通过苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-Eosin staining,HE）证实 mTOR MKOKI 小鼠的比目鱼肌（Soleus）比mTOR MKO和对照组小鼠的肌纤维横切面积小,具有中央细胞核的肌纤维数量多,再生肌纤维数量多,而肌纤维再生相关基因myogenin,IGF-II以及MyH8mRNA水平的表达也都出现显著上调。此外,我们之前也发现dystrophin的调节不需要mTOR激酶的活性。而本研究发现在mTOR MKOKI小鼠的胫骨前肌（Tibialis anterior,TA）和比目鱼肌中,dystrophin的mRNA水平显著下调,这表明dystrophin的正常表达是需要mTOR激酶的活性的。对6周龄小鼠的跖肌（Plantaris,PLA）、腓肠肌（Gastrocnemius,GC）进行过碘酸雪夫式染色（periodic acid schiff,PAS）表明,mTOR MKOKI 小鼠和 mTOR MKO小鼠都出现糖原积累,两者染色程度相似。但是通过进一步的糖原电镜观察发现,mTOR MKOKI肌肉的糖原积累更多,出现聚集的糖原颗粒,肌纤维和肌小节受损。基于此,本研究也进行了糖原定量。初步实验结果表明,mTOR MKOKI小鼠肌糖原是正常对照组的44倍,而mTOR MKO小鼠肌糖原是正常对照组的11倍。为评价肌肉氧化代谢情况,本研究检测了比目鱼肌中的PGC-lα的mRNA表达水平,结果发现mTOR MKOKI小鼠的PGC-1 α的mRNA水平相比于mTOR MKO和正常对照组都显著下调。此外,mTOR MKOKI小鼠比目鱼肌相比于mTOR MKO和正常对照组,其颜色更白,与此相一致的是,其肌红蛋白的mRNA水平显著下调。总的来说,mTOR MKOKI小鼠骨骼肌中激酶失活型mTOR的表达加重了原来在mTOR MKO小鼠中出现的表型,使得小鼠出现早亡,严重的生长缺陷,进行性的肌肉萎缩;肌肉中糖原含量的升高导致了肌纤维结构受损;PGC-1 α的mRNA水平降低表明其氧化代谢能力降低,也证明PGC-1 α的表达需要mTOR激酶活性。肌纤维再生相关基因myogenin,IGF-II,MyH8的mRNA水平升高也证明了 mTOR MKOKI小鼠的肌纤维再生增加。IGF-1在骨骼肌中广泛表达,是维持肌肉正常生长和发育的重要蛋白因子。肌肉中IGF-1过表达的小鼠,表现为肌肉肥大,骨量增加。肌肉特异性敲除GRP94小鼠表现为它的肌肉,肝脏,肾脏,心脏重量下降25%,股骨长度减少4%～7%,GRP94的敲除抑制了IGF1的表达。而SRF敲除小鼠表现为肌肉生长延缓,肌肉量减少,出现肌病,过早死亡等,SRF的敲除也影响了 IGF1的正常表达。因此,本研究检测了 IGF-1的mRNA水平,发现在mTOR MKOKI小鼠和mTOR MKO小鼠中其表达水平并没有显著变化,而且它们的股骨和胫骨长度正常。所以并不是IGF-1的变化导致mTOR MKOKI小鼠出现生长缺陷。此外,在繁育、饲喂小鼠的过程中发现mTOR MKOKI小鼠行动缓慢,进食量看似偏少,所以有必要检测确认其进食量是否正常,是否是进食量减少,营养摄入少,导致其生长迟缓。通过14天的跟踪定量研究发现,mTOR MKOKI小鼠的平均每日进食量偏少,但是通过体重的标准化计算之后发现,mTOR MKOKI小鼠进食量正常,甚至出现略微的增加。所以mTOR MKOKI小鼠的生长缺陷并不是由食量减少所导致的。经检测mTOR MKOKI小鼠的进食后血糖比mTOR MKO小鼠和正常对照组小鼠的水平低。本研究同时检测了 mTOR MKOKI小鼠肌肉是否能为肝糖异生提供前体。丙氨酸在肝脏与肌肉间的葡萄糖-丙氨酸循环起关键性作用。肌肉组织中的氨基酸经转氨基作用将氨基转给丙酮酸生成丙氨酸,经血液运输到肝脏,在肝脏中丙氨酸通过联合脱氨基作用生成丙酮酸和游离氨,可经糖异生作用生成葡萄糖,葡萄糖由血液运输到肌肉组织中沿糖分解途径再产生丙酮酸,后者再接受氨基生成丙氨酸,通过这循环使肌肉中的氨以无毒氨基酸形式运输到肝,同时肝也为肌肉提供了生成丙酮酸的葡萄糖。丙氨酸转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）也被称为谷氨酸丙酮酸转氨酶（glutamate pyruvate transaminase,GPT）。在mTORMKOKI小鼠中,GPT2的mRNA水平、蛋白水平都出现显著下降,这表明肝糖异生的前体丙氨酸的生物合成受影响而出现下降。本研究也进行了大量的分子水平的研究,研究发现,在mTORMKOKI小鼠中,由于负反馈环路S6K/IRS受损:IRS1,Akt的磷酸化位点苏氨酸308（Threonine308）,磷酸化的GSK3蛋白水平都上调,而rmTORC2信号通路中的Akt的磷酸化位点丝氨酸473（Serine473）也出现上调。mTORMKOKI小鼠表现出比mTORMKO小鼠更为明显的糖原储存疾病V（Glycogen storage disease V,GSDV）的特性。糖原储存疾病V也被称作McArdle疾病或肌肉磷酸酶缺陷。糖原磷酸化酶是糖代谢中重要的酶,糖原磷酸化酶催化糖原磷酸化为葡萄糖-1-磷酸（Glucose-1-phosphate,Glc-1-P）,在肌肉中相应的基因为PYGM基因。本研究发现,mTOR MKOKI小鼠中PYGM蛋白水平与mTOR MKO小鼠以及正常对照组小鼠相比显著下调,这表明在mTOR MKOKI小鼠中糖原降解有显著的缺陷。本研究对可能磷酸化Akt磷酸化位点Serine473的蛋白激酶进行识别研究,结果发现整合蛋白连接激酶（Integrin-linked kinase,ILK）,TBK1 激酶（TANK binding kinase 1）的蛋白表达水平与Akt磷酸化位点Serine473的磷酸化蛋白水平表达一致,所以ILK1与TBK1很可能是磷酸化Akt磷酸化位点Serine473的激酶。由于mTOR MKOKI小鼠的肌肉萎缩和肌营养不良特性,本研究对PKB/Akt信号通路对自噬的影响进行了研究。研究发现,在mTOR MKOKI小鼠中p62（也被称为SQSTM1或泛素结合蛋白）,LC3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）以及磷酸化Ulk（Ser317位点）的蛋白表达水平显著提高,因此6周龄的mTORMKOKI小鼠肌肉中的自噬是受抑制的,而mTORMKO小鼠肌肉自噬仍然是激活状态。LC3的免疫染色表明,在mTOR MKOKI小鼠中有更多的LC3斑点聚集,此外需要进一步进行p62的免疫染色来确认肌肉的自噬状态。以往研究发现Akt通过Beclinl磷酸化调节自噬和肿瘤发生过程。由Akt调节Beclin/vimentin的相互作用可能是自噬抑制的一种机制。本研究发现mTOR MKOKI小鼠与mTOR MKO小鼠以及正常对照组小鼠相比,其Beclinl的磷酸化位点Serine295磷酸化蛋白水平显著升高,但是尚未确认Beclinl是否在mTOR MKOKI小鼠肌肉中聚集,所以需要进行进一步的Beclinl免疫荧光染色研究来确认。mTORMKOKI小鼠出生时表型正常,随后迅速出现了生长迟缓,在3周龄提早出现肌营养不良等。在上述研究的基础上,还需要进行检测dystrophin蛋白水平,糖原定量等。它们是证实mTOR激酶失活比mTOR敲除更会严重影响肌肉完整性的重要证据。本研究同时也发现mTOR激酶失活导致肌肉量显著的减少,并影响了机体整体的代谢和器官生长。本研究认为肌肉量的减少导致了肝糖异生前体的减少。为了更加充分的证实这一结论,需要检测在肝脏中葡萄糖-6-磷酸酶（Glucose 6-phosphatase,G6Pase）以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）的 mRNA 水平是否下降。本研究也发现,糖原磷酸酶蛋白几乎没有被检测到,mTORMKOKI小鼠表现为糖原储存疾病V/McArdle疾病的表型。因此需要在肌原细胞中通过过表达gag-Aktl和Akt2来研究糖原磷酸酶mRNA水平和蛋白水平。综合上述,本研究描述对比了 mTOR MKOKI小鼠和mTOR MKO小鼠的表型。本研究发现:1)mTOR激酶失活型等位基因不能补救由于mTOR蛋白缺失造成的相关影响,而且会使这些变化加重恶化;2)肌肉中氧化代谢的维持,dystrophin蛋白的表达需要mTOR激酶活性;3)与MKO小鼠相比,MKOKI小鼠的肌肉中糖原过度累积,导致肌纤维的损伤;4)本研究发现糖原过度累积是由于MKOKI小鼠中更强的Akt过度激活所致。糖原降解抑制也导致肌纤维组织的破坏以及糖原累积症。持续的肌肉Akt1和Akt2激活事实上改善了葡萄糖的摄取以及糖原存储,但是又导致糖原调用受影响,最终导致严重的糖原储存疾病;5)与MKO小鼠相比,MKOKI小鼠的自噬抑制会导致显著的肌肉萎缩、肌营养不良;6)mTOR接触性抑制剂可能在有丝分裂后的组织（如肌肉）中产生多种严重的副作用效应,由于mTOR激酶受抑制,作用于Akt的负反馈信号通路可被激活。