论文部分内容阅读
卵巢是雌性动物重要的生殖器官,是卵泡发育和闭锁的重要器官。卵泡是卵巢的结构和功能单位,始基卵泡形成、卵泡募集、优势卵泡的选择和排卵对母猪繁殖性能起重要作用。卵泡的生长过程伴随着颗粒细胞(Granulosa Cells,GCs)的发育和分化,GCs的增殖和凋亡与卵泡发育和闭锁密切相关。MicroRNA(miRNA)是短的非编码RNA,众多研究表明GCs中miRNA和其靶基因影响着GCs的分子机制,进而影响卵泡的生长发育。本研究在前人研究的基础上,结合课题组前期对母猪卵泡期和黄体期卵巢的miRNA测序及预实验结果,筛选在母猪中显著高表达的miR-21-5p并推测其参与母猪的繁殖过程。首先运用荧光原位杂交(FISH)探究miR-21-5p在猪卵巢组织和GCs中的定位;然后运用流式细胞仪、MTT比色法、ELISA法分别检测miR-21-5p对GCs功能的影响;接着通过生物信息学、构建双荧光素酶报告基因、qRT-PCR和Western blot技术验证miR-21-5p对Smad7的负调控作用;接着运用免疫荧光技术探究Smad7在猪卵巢组织和GCs中的定位;最后运用流式细胞仪、MTT比色法、ELISA法分别检测Smad7对GCs功能的影响。研究结果加深了对猪GCs分子机制的认识,对提高母猪的繁殖性能具有重要的意义。(1)FISH技术显示:miR-21-5p在猪卵泡膜周围和GCs的细胞质中有广泛表达。免疫荧光技术显示:Smad7在猪卵泡膜周围和GCs的细胞核中有广泛表达。(2)流式细胞仪检测结果表明:miR-21-5p或Smad7-siRNA能够抑制GCs凋亡,还均能使S期的细胞显著增多及增殖指数升高。运用MTT比色法佐证,miR-21-5p或Smad7-siRNA能够促进GCs增殖。(3)ELISA法结果表明:转染miR-21-5p mimics或Smad7-siRNA后能够提高猪卵巢GCs的雌二醇含量,降低孕酮含量。(4)生物信息学预测miR-21-5p靶向调节转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-p)信号通路中的关键基因Smad7。进一步通过双荧光素酶报告验证miR-21-5p能够结合Smad7 3’UTR,抑制荧光素酶活性。(5)qRT-PCR和Western blotting结果表明:miR-21-5p能够在转录水平负调控Smad7,在翻译水平负调控Smad7的表达。上述结果揭示了 miR-21-5p能够通过,Smad7抑制猪卵巢GCs凋亡和促进GCs增殖,为深入了解miRNA调控卵巢卵泡发育提供借鉴,同时也为后续研究Smad家族在GCs中的研究奠定基础。