研究背景:心血管系统是人和脊椎动物胚体内最早发育和发挥作用的器官系统。心脏通过一个专门的组织网络——心脏传导系统来精确地启动和传递动作电位,从而实现心房和心室的协调收缩。窦房结、房室结、房室束(希氏束)与左右束支近端部分构成中枢传导系统,左右束支远端部分和外周心室传导网络构成周围传导系统。由于胚胎心脏发育是一个复杂的过程,以及人胚胎标本的特殊性,人胚胎传导系统的发育机制尚未阐明。近几十年,随着分子生物学技术的快速发展,应用细胞追踪、转基因、条件性基因敲除等技术对鸡胚、啮齿类动物和斑马鱼胚胎心脏传导系统发育的研究表明,传导系统的发育和分化依赖于体内复杂的信号网络,包括T-box转录因子Tbx3。在小鼠胚胎,Tbx3作为阻遏蛋白可抑制腔室工作心肌特异性蛋白(心钠素Nppa、快传导缝隙连接蛋白CX43和CX40等)的表达,从而保证Tbx3阳性的原始心肌细胞分化成中枢传导系统的心肌细胞,而不向腔室工作心肌方向分化。转基因动物研究表明,Tbx3异位表达会出现传导系统功能异常或致命性心律失常的发生。肌细胞特异性中间丝结蛋白desmin作为细胞骨架的重要结构,在Z线周围将肌原纤维、肌膜和细胞核进行整合,维持心肌细胞结构完整性,并参与心肌细胞闰盘的装配。在成体,Desmin通过核骨架细胞骨架连接复合体(LINC)与位于核膜内层的核纤层蛋白LaminA相连,构成贯穿于细胞核和细胞质的统一网架结构体系。文献报导,人类编码desmin的DES基因突变导致显著性心律失常和频发的心源性死亡;人类编码LaminA的LMNA基因突变通常以心传导系统疾病或心律失常为首发症状,提示desmin和LaminA与人类心脏传导系统的发育密切相关。然而,有关二者在人胚心脏表达模式的研究报道甚少,尤其缺乏人胚早期的资料,限制了实验研究从动物到人的推理。本研究系统观察了Carnegie10-20期人胚心脏传导系统的形态演变过程,阐述了中间丝蛋白desmin和LaminA在传导系统的时空表达模式及与Tbx3、Isl-1和Nkx2.5等不同转录因子表达模式的关系。与模型动物相比,我们的数据为理解人类DES和LMNA基因突变引起的心律失常提供了直接的形态学基础。第一部分中间丝蛋白desmin、LaminA在早期人胚心脏传导系统的时空表达特点及意义目的:阐明中间丝蛋白desmin和LaminA在人胚胎早期心脏发育过程中传导系统的时空表达模式及与Tbx3等转录因子表达模式的关系,探讨desmin和LaminA在心脏传导系统发育中的作用,为人类DES和LMNA基因突变导致的传导功能障碍发病机制的研究提供形态学依据。方法:收集自然流产的形态完整的Carnegie10-20期(受精后3-8周)人胚,制作心脏连续切片进行HE,免疫组织化学和免疫荧光染色。本实验选用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体标记早期原始心肌细胞,抗心肌肌球蛋白重链(MHC)抗体标记横纹肌心肌细胞,抗Tbx3抗体标记人胚心脏中枢传导系统,系统观察结蛋白(desmin)、核纤层蛋白A(LaminA)和缝隙连接蛋白43(Connexin43)在人胚心脏传导系统的时空表达模式。为了更好地理解胚胎心脏发育过程,部分胚胎染色结果进行计算机三维重建。结果:人胚发育第10期,Tbx3在心脏广泛表达,阳性结果弥漫至除静脉窦外的MHC或α-SMA阳性的心肌细胞,但较强的desmin阳性颗粒主要局限在中枢传导系统的房室管右侧壁。人胚发育第11期,房室管内侧覆以间充质细胞构成的心内膜垫,Tbx3阳性表达主要局限于房室管壁心肌细胞,desmin在房室管壁心肌细胞的表达与Tbx3表达模式相同。LaminA首先在心室近腔面的小梁心肌,即蒲肯野纤维阳性表达。人胚发育第12期,人胚房室管前壁可见Tbx3和desmin双阳性细胞从腹侧向背侧延伸经右心房顶壁与发育中的假隔融合,房室管后壁的Tbx3和desmin阳性细胞向房间隔基部延伸扩展到左心房底壁的左肺嵴,Tbx3阳性结果随近左肺嵴逐渐减弱直至消失。人胚发育第13期,房室管背侧壁心肌增厚区为人胚房室结原基,心肌细胞排列稀疏,胞质嗜酸性弱,Tbx3、desmin、LaminA和Nkx2.5表达强度强于心房或心室心肌细胞,但α-SMA表达缺失。人胚发育第14期,希氏束出现并与房室管右背侧壁相连,二者共同表达desmin和Tbx3,desmin阳性表达范围从中枢传导系统扩展到周围传导系统的左右束支远端和蒲肯野纤维。人胚发育第15期和17期,窦房结和房室结明显可辨,窦房结借右静脉瓣与房室管背侧的房室结相延续,左静脉瓣向房室管方向延伸并插入房间隔尖端的的背侧间充质突内,这两条位于窦房结和房室结之间的传导通路在人胚发育17-20期始终可以观察到并较好地表达Tbx3和desmin。房室结连接希氏束,希氏束与左右束支和蒲肯野纤维相连。因此,从窦房结到心室蒲肯野纤维之间连续的传导通路的雏形基本建立,可见Tbx3阳性表达部位局限在中枢传导系统。Desmin阳性表达早期在中枢传导系统,表达时间早于Tbx3,但在人胚发育第20期扩展到除致密心肌外的由左右束支远段和心室小梁心肌构成的周围传导系统和工作心肌。LaminA在传导系统的表达明显晚于desmin,阳性表达范围从周围传导系统的蒲肯野纤维逐渐向上延伸至中枢传导系统各结构,直至人胚发育第20期,窦房结才获得LaminA较强的阳性表达。结论:1.Desmin与Tbx3在早期人胚心脏中枢传导系统具有相似的表达模式提示,胞浆骨架蛋白desmin参与中枢传导系统基本框架的搭建,Tbx3促进原始心肌细胞分化为中枢传导系统的慢传导心肌细胞,二者协同作用确保心脏形态发生与其传导功能相适应。2.联合应用desmin和Tbx3作为标记蛋白可以很好地显示人胚心脏早期发育过程中从窦房结到蒲肯野纤维之间完整的心脏传导系统。3.LaminA在人胚心脏传导系统的表达晚于desmin,阳性表达部位从周围传导系统逐渐延伸到中枢传导系统,这两种中间丝蛋白不同的表达模式提示,直至人胚发育至20期,二者在结构和功能上尚未建立偶联。4.人胚心脏周围传导系统和心房工作心肌的发育需要desmin的参与。第二部分人胚心脏静脉窦和窦房结的早期发育目的:研究人胚心脏窦房结的起源和发育的动态形态演变过程,探明转录因子Tbx3、Isl1的表达与窦房结发育的形态学关系,为揭示人类先天性起搏组织异常的病因提供宝贵的形态学资料。方法:选用α-SMA、MHC单克隆抗体和抗Tbx3、抗Isl-1和抗Nkx2.5多克隆抗体对Carnegie10-20期(受精后3-8周)人胚心脏连续石蜡切片进行免疫组织化学染色。结果:人胚胎发育第10期,静脉窦初现于共同心房的尾端,免疫组织化学染色显示早期心肌特异性蛋白α-SMA阴性、Nkx2.5阴性和Isl-1阳性,可见Isl-1阳性细胞从前肠腹侧的间充质细胞延续至静脉窦背侧壁。人胚发育第11期,静脉窦开始表达α-SMA,人胚发育第12期,Nkx2.5阴性的静脉窦头端与Nkx2.5阳性表达的右心耳尾端延续并折叠成两层不同成分构成的右静脉瓣,右静脉瓣向心脏头端延续与发育中的假隔融合。人胚发育第13期,左静脉瓣发育,左右静脉瓣向头端延伸并与假隔相互融合,显示Nkx2.5阳性、Isl1阴性的表达模式。与心房其它部位的心肌表达特点不同,介于两瓣膜基部之间右心房壁上的心肌细胞显Nkx2.5阴性和Isl1阳性,提示这部分心肌细胞来源于静脉窦。人胚发育第14期,心尾端来源于静脉窦未融入到心房壁的Isl1阳性细胞参与构成右静脉窦角和左侧的冠状窦,右静脉窦角管壁较13期明显增厚,位于右上腔静脉和右心房之间,免疫组织化学染色显示右静脉窦角表达较强的α-SMA和desmin,但未检测到Tbx3阳性颗粒。可见前肠腹侧Isl-1阳性的间充质细胞借肺静脉右侧的背侧间充质突延伸到增厚的右静脉窦角尾端。人胚胎发育第15期,窦房结位于心脏的头端、右心房的背侧,窦房结头端包绕右心房和右上腔静脉连接处,尾端沿右静脉瓣(界嵴)走形,在不同切面窦房结形态呈现为逗号样或U形结构。窦房结头端已广泛表达desmin,但慢传导系标记物Tbx3才开始阳性表达,与早期心肌特异性蛋白α-SMA的表达模式呈现严格的互补性,即获得Tbx3阳性表达的窦房结区域同时失去α-SMA的表达并演变为分布稀疏的结构。人胚胎发育第16期开始,Tbx3的表达沿右静脉瓣进一步向窦房结头部远侧端延伸。直至胚胎发育第20期,横纹肌特异性蛋白MHC已蔓延到整个窦房结,仍有部分窦房结头端显Tbx3阴性和α-SMA阳性的互补表达模式,第二生心区心前体细胞标记物Isl1在窦房结头端始终保持强阳性表达。结论:1.人胚静脉窦最早于人胚胎发育第10期发育,窦壁为间充质细胞。间充质细胞于第11期开始心肌化,第12期发生心肌化的心肌细胞从静脉窦头端向尾端逐渐演变为具有横纹的心肌细胞。2.人胚胎发育第13期,右心房壁上界于左右静脉瓣之间的部分构成窦房结尾部的原基,显示Isl-1阳性、Nkx2.5阴性的表达特点;第14期,连接右上腔静脉和右心房的右静脉窦角尾端形成窦房结头部的原基;第15期,心脏经历汇聚后,窦房结原基从右心房的尾端返折到右心房的头端,达到晚期人胚和成人的解剖学位置。3.窦房结获得成人解剖学位置后,Tbx3阳性表达部位沿右静脉瓣逐步向窦房结头部近心房侧扩展,而且Tbx3和早期心肌特异性蛋白α-SMA的表达模式呈现严格的互补性,提示窦房结细胞从尾端向头端逐步分化与成熟。4.与小鼠胚胎相同,人胚静脉窦和窦房结具有特殊的Nkx2.5阴性、Isl-1阳性表达模式,可选用转录因子Nkx2.5和Isl-1作为理想的标记物。