第一部分体外受精对小鼠生长发育的影响及其肝脏和骨骼肌Igf2/H19的表达与表观遗传修饰研究目的：研究IVF小鼠的生长发育、肝脏及骨骼肌印记基因Igf2、H19、Igf2r与微小RNA (microRNA,miRNA)的表达、以及Igf2/H19差异甲基化区(differentially methylated region, DMR)的甲基化状况,阐明IVF对出生小鼠生长发育的短期及中长期效应和发生机制。材料和方法：1.利用C57BL/6J小鼠建立IVF及体内受精小鼠模型。比较IVF与体内受精子代的妊娠率、胎仔数、怀孕天数、性别比率及死亡率。2.以IVF子代为研究对象,以体内受精子代为对照组,自出生第1天起至第10周性成熟期测量各组小鼠体重变化；于3周(断乳期),10周(性成熟期),1.5年(老年期)取小鼠各器官,测量各组器官重量。3.通过定量PCR技术,检测出生、3周、10周及1.5年时期,肝脏及骨骼肌上印记基因Igf2、H19、Igf2r与miRNA-483的表达。4.利用亚硫酸氢盐PCR (bisulfite PCR, BSP)及克隆测序检测IVF小鼠的H19DMR、Igf2DMR2、Igf2r DMR2各位点的甲基化情况,再利用焦磷酸测序技术进行验证。5.通过western-blot技术,检测出生、3周、10周及1.5年时期,肝脏及骨骼肌上IGF2蛋白的表达。结果：1.建立IVF及体内受精小鼠各51只。两组小鼠在妊娠率、胎仔数、怀孕天数、性别比率及死亡率上差异无统计学意义。2.在出生时,IVF体重高于体内受精组,而发育至2周及3周时,IVF体重显著低于体内受精组,3周后两组的体重差异无统计学意义。器官重量,除去10周时IVF的脾脏重量低于体内受精组,两组小鼠的各器官重量在3周,10周,1.5年时差异均无统计学意义。3.IVF对出生后子代肝脏及骨骼肌Igf2/H19及miRNA-483表达的影响(1)肝脏上Igf2/H19及miRNA-483表达分析在出生及3周时,Igf2、H19与miRNA-483的表达在IVF组与体内受精组之间存在差异并有统计学意义。10周时,Igf2、H19及miRNA-483的表达在两组之间差异无统计学意义。但到老年时,Igf2、H19与miRNA-483的表达在IVF组与体内受精组之间又出现差异并有统计学意义。而在整个生长发育阶段,Igf2r的表达在两组之间差异均无统计学意义。(2)骨骼肌上Igf2/H19及miRNA-483表达分析在3周时,Igf2、H19与miRNA-483的表达在IVF组与体内受精组之间存在差异并有统计学意义。10周时,Igf2、H19及miRNA-483的表达在两组之间差异无统计学意义。但到老年时,Igf2、H19与miRNA-483的表达在IVF组与体内受精组之间又出现差异并有统计学意义。Igf2r的表达在3周及10周时,两组之间差异无统计学差异。但在老年时,Igf2r的表达在IVF组显著低于体内受精组。4.IVF对出生后子代肝脏及骨骼肌Igf2/H19DMR与Ig/2r DMR2甲基化的影响依据上述Igf2及H19的长期表达差异,选取H19DMR的12个甲基化位点,Igf2DMR2的13个甲基化位点进行BSP并克隆测序,结果发现：H19DMR的第6,7,8三个CpG位点,Ig/2DMR2的第4,5CpG位点在IVF组易出现甲基率的改变,因此,进一步对H19DMR第6到8CpG位点,Igf2r DMR2的第1到5CpG位点利用焦磷酸测序进行验证。同时选择Igf2r DMR2的4个CpG位点进行甲基化状况分析。(1)肝脏Igf2/H19DMR与Ig/2r DMR2的甲基化状态分析1)在出生时,H19DMR的甲基化率在IVF组与体内组之间存在差异并有统计学意义。在3周及10周时,H19DMR的甲基化率在两组之间差异无统计学意义。但到1.5年时,H19DMR的甲基化率在IVF组与体内受精组之间又出现差异并有统计学意义。2)在出生及3周时,H19DMR2的甲基化率在IVF组与体内组之间存在差异并有统计学意义。在10周时,Igf2DMR2的甲基化率在两组之间差异无统计学意义。但到1.5年时,Igf2DMR2的甲基化率在IVF组与体内受精组之间又出现差异并有统计学意义。3)在整个生长发育阶段,Igf2r DMR2的甲基化率在两组之间差异均无统计学意义。(2)骨骼肌Igf2/H19DMR与Igf2r DMR2的甲基化状态分析1)在3周时,H19DMR的第6到8三个CpG位点的甲基化率在IVF组均显著低于体内受精组。但在10周及1.5年时,H19DMR的甲基化率在两组之间差异无统计学意义。2)在3周时,Igf2DMR2的甲基化率在IVF组与体内组之间存在差异并有统计学意义。10周时,Igf2DMR2的甲基化率在两组之间差异无统计学意义。但到1.5年时,Igf2DMR2的甲基化率在IVF组与体内受精组之间又出现差异并有统计学意义。3)在3周及10周时,Igf2r DMR2的甲基化率在两组之间差异无统计学意义。但在1.5年时,Igf2r DMR2的4个CpG位点甲基化率在IVF组均高于体内受精组并有统计学意义。5.IVF对出生后子代肝脏及骨骼肌IGF2蛋白表达的影响在3周时期,无论是在肝脏还是骨骼肌,IGF2蛋白的表达在IVF组均显著低于体内受精组。其它生长发育阶段IGF2蛋白的表达在两组间差异无统计学差异。结论：1.IVF可影响子代的生长发育,但随着年龄的增长,这种改变逐渐修复。2.IVF不仅影响子代早期肝脏及骨骼肌Igf2、H19与miRNA-483的表达,还影响它们在老年时期的表达。3.IVF影响Igf2/H19的表达可能与它们的DMR区调控及miRNA-483相关,提示IVF可导致表观遗传学的改变。第二部分ART老年小鼠血脂代谢的改变及其机制研究目的：研究ART出生小鼠在老年时期的血脂代谢情况,探索ART对子代血脂改变的调控机制,明确ART致成年后疾病的发病风险,及阐明ART影响子代成年后健康的关键作用环节及致病时间窗。材料和方法：1.ART老年小鼠表型和血脂代谢检测(1)应用已建好的ART老年C57BL/6J小鼠模型包括：12只IVF小鼠、12只ICSI小鼠、10只IVM小鼠以及16只体内受精小鼠(每组小鼠雌雄比率相似),分析各组小鼠的表型和血脂代谢等状况。(2)通过水迷宫及恐惧学行为实验,分析各组ART老年小鼠的学习记忆能力。(3)利用血压检测仪,检测各组ART老年小鼠的血压及心率情况。(4)采用腹腔内葡萄糖注射实验,对ART各组小鼠在老年时期血糖及糖耐量进行检测。(5)利用生化分析仪,对ART各组老年小鼠血清进行生化分析包括血脂生化及肝肾生化。同时应用ELISA技术,检测各组老年小鼠血清胰岛素水平。(6)对各组ART老年小鼠的各器官进行称量,并通过HE染色对ART小鼠的不同器官进行病理学分析。2.机制学研究依据ART老年小鼠血脂代谢和器官病理改变的观察结果,选择脂类代谢关键调节通路：胰岛素诱导基因(insulin-induced gene, INSIG)、胆固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein, SREBP)以及胆固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein, SCAP),即INSIG-SCAP-SREBP为目标基因,选取肝脏和肺脏为靶组织,进行老年小鼠血脂代谢改变的发生机制研究。(1)ART老年小鼠INSIG-SCAP-SREBP基因表达分析利用荧光及探针定量RT-PCR检测ART老年小鼠肝脏和肺脏组织Insigl, Insig2, Scap, Srebf1, Srebf2, miR-33与miR-122的表达变化。(2)ART老年小鼠INSIG-SCAP-SREBP基因修饰分析应用BSP及焦磷酸测序技术检测ART老年小鼠肝脏和肺脏组织INSIG-SCAP-SREBP的CpG岛的甲基化状态。(3)ART老年小鼠INSIG-SCAP-SREBP蛋白表达分析通过western-blot及免疫组化等检测INSIG-SCAP-SREBP各蛋白在肝脏和肺脏组织的表达情况。(4) IVM的MⅡ卵母细胞INSIG-SCAP-SREBP表达分析利用定量RT-PCR及免疫荧光技术,检测IVM的MII卵母细胞INSIG-SCAP-SREBP基因及蛋白的表达变化。结果：1.ART老年子代的表型和血脂变化情况(1)各组ART老年小鼠与体内受精组相比较,学习记忆能力差异无统计学意义。(2)IVM老年小鼠血压显著高于IVF组、ICSI组及体内受精组,同时IVM组的心率显著高于体内受精组。IVF及ICSI组分别与体内组比较,在血压及心率上差异均无统计学意义。(3) ICSI组老年小鼠在进行糖耐量实验时,于葡萄糖注射30min后血糖水平显著低于体内受精组,差异具有统计学意义。(4)IVM及ICSI组的血清生化分析提示：与体内组比较,两组老年小鼠在血胆固醇、血脂蛋白(LDL-C, HDL-C及Apo-A)、血AST/ALT、血急性C反应蛋白存在差异并有统计学意义。另外,IVM组的血清胰导素水平显著高于体内受精组。(5) ICSI组及IVM组的肾脏和心脏重量均显著高于体内组及IVF组,差异具有统计学意义。另外,IVM组的胰腺及肝脏重量显著高于其它三组。(6)HE染色结果显示：IVM组老年小鼠的肾脏存在脂类改变；ICSI及IVF老年小鼠肺脏均存在炎性变化。2.在肝脏上,各组ART老年小鼠INSIG-SCAP-SREBP的表达变化依据上述血清生化分析结果,血脂改变主要发生于ICSI组及IVM组,因此肝脏组织血脂代谢研究以ART老年子代包括IVF组、ICSI组及IVM组为研究对象,以体内受精子代为对照。(1) mRNA水平：Insig1, Scap, Srebf1, Srebf2基因的表达在IVM及ICSI组的表达均显著高于IVF组及体内受精组(2-4倍,P<0.01)。另外,在IVM组及ICSI组,miR-33及miR-122表达均显著低于IVF及体内受精组。(2)DNA水平：Insig1, Scap, Srebf1, Srebf2的CpG岛的甲基化位点在IVM与ICSI组均与体内组存在甲基化率的差异,并有统计学意义。(3)蛋白水平：IVM组及ICSI组的SCAP蛋白表达显著高于IVF组及体内受精组,并有统计学意义。3.在肺脏上,各组ART老年小鼠INSIG-SCAP-SREBP的表达变化依据上述组织病理学结果,肺部炎症病变主要发生于IVF组及ICSI组,因此肺脏组织研究以ART老年子代包括IVF组及ICSI组为研究对象,以体内受精子代为对照；(1)mRNA水平：Insig1, Insig2, Scap, Srebf1, Srebf2基因的表达在ICSI及IVF组的表达均显著低于体内受精组,并有统计学意义。(2) DNA水平：Insig1, Scap, Srebf1, Srebf2的CpG岛的甲基化位点在IVF与ICSI组均与体内组存在甲基化率的差异,并有统计学意义。尤其是在病理肺脏上,各基因的甲基化率存在显著变化。(3)蛋白水平：western-blot及免疫组化结果显示,IVF及ICSI组与体内受精比较,各蛋白无差异。4.IVM的MⅡ卵母细胞INSIG-SCAP-SREBP的表达变化依据上述表型及血脂结果,血压及血脂变化主要发生于IVM组,因此卵子研究以400个IVM的MⅡ卵母细胞为实验对象,400个体内成熟卵子为对照。(1) mRNA水平：Insig1, Scap, Srebf1基因的表达在IVM卵子上的表达显著高于体内成熟卵子,并有统计学意义。另外,IVM卵子的miR-33及miR-122表达显著低于体内成熟卵子。(2)蛋白水平：INSIG1蛋白及SCAP蛋白在IVM卵子与体内成熟卵子之间,表达差异存在统计学意义。结论：1.IVM可影响子代老年时期的血压。2.IVM及ICSI技术可导致子代老年时期血脂、血胰导素及器官病理改变。3.ART影响子代老年时期血脂代谢可能与INSIG-SCAP-SREBP的表达变化相关。4.ART导致INSIG-SCAP-SREBP的表达变化可能与它们CpG岛的甲基化率改变及相应的微小,RNA的表达改变有关。5.IVM卵子上的INSIG-SCAP-SREBP的表达变化,进一步验证了胚源性疾病学说。