论文部分内容阅读
目的自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）是一种复杂的免疫介导的肝脏炎症性疾病,其病因和发病机制尚未明确,但学界普遍认为,在肝脏微血管中高度表达的自然杀伤T（Natural killer T,NKT）细胞在AIH发病中起着重要的作用。本研究旨在利用C6orf120基因敲除大鼠实验模型阐述C6orf120基因对NKT细胞的影响及其在AIH发病过程中的作用和可能的分子机制。方法1.AIH模型制备:抽取野生型（wild type,WT）大鼠和C6orf120基因敲除型（C6orf120-/-）大鼠各 24 只,随机分成刀豆蛋白 A（Concanavalin A,Con A）诱导 0 h组、Con A诱导12 h组和ConA诱导24h组共3组,每组两种基因型大鼠各8只。其中Con A诱导12 h组和Con A诱导24 h组大鼠以Con A 35 mg/kg的剂量舌下静脉注射建立AIH大鼠模型,于造模12h、24h后与未经ConA注射的ConA诱导0h组大鼠一起处死。留取大鼠外周血、肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结用于后续研究。2.肝损伤评估:检测WT大鼠和C6orf120-/-大鼠肝功能生化指标丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）水平以及肝脏病理组织切片苏木精-伊红（H&E）染色以评估肝脏损伤程度。3.流式细胞术:分别制备WT大鼠和C6orf1 20-/-大鼠的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）、肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结的单细胞悬液,流式细胞术分析CD3+CD161+NKT细胞表达频率以及CD3+CD161+CD314+NKT细胞活化表达频率。4.蛋白质印迹实验（Western blot）技术:检测WT大鼠和C(6orf120-/-大鼠肝脏组织中 Fas、FasL、P-JAK1、P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3 等蛋白的表达。5.免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）技术:检测大鼠肝脏CD314（NKG2D）、Fas和FasL等蛋白表达量。6.实时荧光量定量PCR（qRT-PCR）技术:检测肝组织中IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-6、iNOS等炎症因子以及CXCL16、CD1d、Fas、FasL的转录水平。7.高通量液相蛋白芯片检测（Luminex）技术:分析WT大鼠和C6orf120-/-大鼠血浆中细胞因子的差异。结果1.WT大鼠和C6orf120-/-大鼠肝损伤的差异:经Con A诱导后,与C6orf120-/-大鼠相比,WT大鼠血浆ALT、AST水平明显升高,同时肝脏H&E染色显示WT大鼠肝板结构塌陷更严重、汇管区炎症细胞浸润更显著、肝脏坏死区域更广泛,肝损伤评分明显升高。2.C6orf120基因缺失对NKT细胞的表达频率及其活化的影响:经Con A诱导后,与WT大鼠相比,C6orf120-/-大鼠外周血、肝脏、脾脏中CD3+CD161+NKT细胞表达频率显著上调,肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结内CD3+CD161+CD314+NKT细胞活化的表达频率显著下调;IHC结果显示C6orf120-/-大鼠肝脏CD314（NKG2D）蛋白表达水平较WT大鼠显著下调;3.C6orf120基因缺失对NKT细胞功能的影响:与WT大鼠相比,C6orf120-/-大鼠肝脏CXCL16 mRNA表达水平显著下调,CD1d mRNA表达水平显著上调;4.C6orf120基因缺失对细胞因子表达的影响:qRT-PCR结果显示,C6orf120-/-大鼠肝脏内TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17、iNOS的转录水平较WT大鼠显著下调;Luminex检测结果显示,与WT大鼠相比,C6orf120-/-大鼠血浆中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-β的表达水平显著下调,IL-4的表达水平显著上调;5.C6orf120基因缺失抑制凋亡因子Fas/FasL的表达:与WT大鼠相比,C6orf120-/-大鼠肝脏中Fas、FasL转录水平以及蛋白表达水平显著下调;6.C6orf120基因缺失抑制JAK-STAT通路激活:与WT大鼠相比,C6orfl20-/-大鼠肝组织中P-JAK1、P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表达水平显著下调。结论C6orf120基因敲除可以减轻Con A诱导的大鼠自身免疫性肝损伤,免疫表型为上调NKT细胞频数、抑制NKT细胞的活化,上调抗炎细胞因子分泌、下调促炎细胞因子产生、抑制肝细胞凋亡。C6orf120基因缺失对大鼠AIH的影响,其分子机制可能部分与Fas/FasL、JAK-STAT通路抑制有关。