蓝藻作为革兰氏阴性菌及地球上最早出现的光合放氧生物,对外界环境变化有较强的适应能力。蓝藻可以感应外界光信号强弱,并通过趋光或避光运动调整自己位置,从而使自己处于相对有利的环境生长,蓝藻如何感应光照信号来调控自身运动的机制有待进一步研究。同时,蓝藻可以利用光能进行光合自养生长,其光合作用机制与真核光合放氧生物高度相似,光合机构组成,如两大光系统复合体也与高等植物高度保守,研究蓝藻光系统组装机制对阐释光合放氧生物光系统复合体组装过程具有借鉴意义。本文以模式蓝藻集胞藻PCC 6803为实验材料,对可能参与趋光运动及光系统组装的基因进行定向敲除,通过前期筛选及后续功能研究,鉴定到Sycrp2和Piaf分别在集胞藻PCC 6803的趋光运动和光系统I组装过程中发挥重要作用,具体实验结果如下:1.通过选取集胞藻PCC 6803中含有GAF,PAS等可能结合发色团感光结构域的未知功能蛋白编码基因,以及已报道参与到调控趋光运动基因的同源基因进行定向敲除,在不同光质下比较野生型藻株和突变株的趋光运动能力,筛选到sycrp2突变株丧失趋光运动能力,为后续研究Sycrp2在调控集胞藻PCC 6803的趋光运动中的功能提供前期基础。2.借助slr0168中性平台将sycrp2基因回补到sycrp2::C.K2突变株,得到sycrp2-com互补株,趋光运动检测发现sycrp2-com互补株恢复了趋光运动能力,证实sycrp2基因确实在集胞藻PCC 6803的趋光运动过程中发挥功能。利用负染法处理各藻株并结合透射电镜观察发现,sycrp2::C.K2突变株表层菌毛结构基本消失,而野生型及sycrp2-com互补株表层菌毛结构清晰可见,表明表层菌毛结构消失是sycrp2::C.K2突变株丧失运动能力的直接原因。通过荧光定量PCR实验检测野生型与sycrp2::C.K2突变株中参与运动相关基因表达水平发现,sycrp2::C.K2突变株中小型菌毛亚基编码基因pilA9-pilA11表达水平较野生型显著下降。酵母双杂交实验及pull-down分析表明Sycrp2可以与调控趋光运动蛋白Sycrp1相互作用,且Sycrp2及Sycrp1自身也都可以发生相互作用。凝胶阻滞实验表明Sycrp1可特异性结合到pilA9操纵子上游区域,而Sycrp2则不具该特性。综合以上结果表明,Sycrp2通过与Sycrp1相互作用共同调控pilA9-pilA11操纵子表达,进而影响菌毛结构合成及细胞运动。3.通过选取集胞藻PCC 6803中12个未知功能叶绿体保守蛋白编码基因(ycf)进行定向敲除,发现无法获得分离纯化完全的y1,y2,y6,y9,y12突变株。正常光照培养下的生长速率测定显示,y2,y9及y10突变株的光合自养生长速率较野生型藻株明显减慢,而其他突变株与野生型无显著差异。光合活性测定结果表明,y6突变株在暗适应及光适应后的光系统Ⅱ活性均低于野生型藻株,表明Y6可能在PSII的形成中发挥功能。同时,y10突变株仅在光适应下的光系统Ⅱ活性低于野生型,而在暗适应后的光系统Ⅱ活性与野生型藻株没有差异,表明y10突变会影响藻株光系统Ⅱ后电子传递速率。后续实验着重研究可敲除分离完全的y10基因在集胞藻光合作用中的功能。4.将Y10命名为光系统Ⅰ组装因子,即Piaf。借助slr0168中性平台将piaf回补到piaf-KO突变株中得到piaf-com互补株,同时将piaf下游基因piaf-down插入失活获得piaf-down-KO突变株。光合自养生长测定结果表明,除piaf-KO突变株生长速度显著慢于野生型藻株外,其他藻株生长速度与野生型一致,证实Piaf的敲除确实降低了藻株光合自养生长速率。电镜观察发现piaf-KO突变株中类囊体膜间距与野生型相比显著增大。亚细胞定位,光合生理测定,以及生化分析结果表明,Piaf定位于类囊体膜上,Piaf缺失显著影响光系统I的形成。荧光定量PCR及免疫印迹结果表明,Piaf的敲除特异性影响光系统Ⅰ组分的积累,而对其转录没有影响。综合体内外pull-down,LC-MS/MS,以及酵母双杂交实验结果,证明Piaf可以与光系统I组装因子Ycf3发生相互作用,二者在集胞藻中协同参与到光系统Ⅰ组装过程中,且Piaf的缺失对Ycf3在类囊体膜上的积累没有影响。氨基酸序列比对分析发现Piaf及其同源蛋白在蓝藻及灰胞藻中分布保守,而在其他真核光合放氧生物中丢失,说明Piaf为一个古老的存在于蓝藻及灰胞藻中的光系统I组装因子。