论文部分内容阅读
由食源性病原菌引起的疾病不仅会造成人员的伤亡,而且会引发重大的经济损失,特别在资源匮乏的发展中国家或地区。因此建立快速便捷、成本低廉且灵敏特异的食源性病原菌即时现场快速检测（point of care test,POCT）方法尤为重要。近年来,电化学由于其具有成本相对低廉、响应迅速、可微型化、构造灵活等优势,在POCT领域引起了广泛的关注。同时,新发展的有机-无机纳米花材料、CRISPR/Cas、引物交换反应（PER）等技术,可应用并作为电化学生物传感器的生物识别元件及信号放大策略,使电化学生物传感器的灵敏性、特异性等性能有了飞跃式的进步。基于此,本论文设计并建立大肠杆菌O157:H7及沙门菌的新型电化学生物传感器检测方法,主要包括以下三个部分:1.基于适配体及包埋亚甲基蓝的有机-无机纳米花,构建大肠杆菌O157:H7的电化学生物传感器。构建了一种用于病原菌灵敏检测的三明治式电化学生物传感器。在该生物传感器平台上,采用简易“一锅法”合成了包埋亚甲基蓝（MB）的有机-无机纳米花（MB@MI）作为新型电化学信号标签,主要由特异性识别E.coli O157:H7适配体magainin I（MI）、Cu3（PO4）2和MB组成,靶标E.coli O157:H7可特异性地与金电极表面修饰的适配体及MB@MI纳米复合材料结合形成夹心三明治结构,基于产生的电流信号变化强弱可实现E.coli O157:H7的定量测定。在最佳反应状态下,该生物传感器的线性分析范围为10~2～10~7 CFU/m L,检出限为32 CFU/m L,同时具有良好的特异性、重复性和稳定性。实际样品进一步验证表明该方法在临床诊断中检测食源性病原体具有很大潜能。2.基于包埋二茂铁的有机-无机纳米花,建立鼠伤寒沙门菌高灵敏性电化学生物传感器。包埋二茂铁（Fc）的有机-无机纳米花（Fc@MI）用作构建电化学生物传感器的电信号放大探针,该生物传感器能够灵敏、快速的检测鼠伤寒沙门菌。此电化学信号放大探针通过绿色简易一锅法,将二茂铁封装在抗菌肽-Cu3（PO4）2有机-无机纳米花材料中形成。首先,表面修饰抗体的磁珠（DBs）捕获靶标菌,可特异性结合免疫分析Fc@MI电信号标签,丝网印刷碳电极作为电信号检测平台,从而特异性检测靶标鼠伤寒沙门菌。基于该免疫传感器平台的检测限低至3 CFU/m L,线性范围区间为10～10~7 CFU/m L,具有良好的特异性,为食品安全检测领域提供了新的技术。3.基于CRISPR/Cas12a和引物交换反应,建立大肠杆菌O157:H7电化学生物传感器。基于CRISPR/Cas12a和引物交换反应（PER）构建了一种电化学生物传感器,该生物传感器无需提取病原菌核酸,即可实现病原菌的灵敏检测。功能性靶标DNA适配体锁扣住PER发夹环装置,在没有目标致病菌的情况下可有效防止引物延伸。当靶标存在时触发PER发夹的解锁,引发PER反应,产生的产物单链ss DNA可激活Cas12a反式切割DNA酶活性,通过裂解电极表面具有电化学活性分子的MB-DNA,引起金电极表面电化学信号降低。该电化学生物传感器实现对靶标E.coli O157:H7的定性及定量检测,范围为10～10~6 CFU/m L,检测限为19CFU/m L。研究结果表明,基于CRISPR/Cas12a和PER的电化学生物传感器具有良好的实际应用前景。此外,验证了所建立的传感方法具有在复杂环境中检测靶标的实际应用能力,初步探索了CRISPR/PER平台在电化学生物分析中的应用。综上所述,本论文基于有机-无机纳米花材料、核酸等温扩增技术、CRSIPR/Cas12a基因编辑系统等,构建了三种灵敏快速的食源性病原菌电化学生物传感器,为食品安全领域的临床研究提供了新的科学借鉴。