高剪切力对血管内皮细胞自噬状态的影响及其机制的探索

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目的:本文通过观察高剪切力对人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)自噬状态的影响,探讨P53通路在高剪切力诱导自噬中的作用,为流体剪切力致动脉粥样硬化分布差异性提供理论依据。方法:1.选用人脐静脉内皮细胞株HUVECs,用体外平行平板流动腔系统模拟血管内皮细胞在体内受到的流体剪切力。2.在高剪切力作用下设置时间梯度分别为0min、5min、15min、30min、45min和60min,用western blot法检测自噬相关蛋白LC3II/LC3I和p62蛋白表达量的变化。3.设未施加剪切力的HUVECs为阴性对照组,实验组分别在有或无巴弗洛霉素A1(bafilomycinA1)的培养基中预处理2小时后再施加高剪切力60min,用western blot法检测并比较上述三组自噬相关蛋白LC3II/LC3I和p62蛋白表达量的变化。4.用western blot法比较无剪切力组和高剪切力组P53蛋白的表达量,并用qPCR的方法检测高低剪切力下P53靶基因Sesn1的转录水平。5.采用P53抑制剂Pifithrin-α预处理HUVECs,用western blot法检测P53抑制剂对高剪切力下自噬相关蛋白LC3II/LC3I和p62表达量的影响。结果:1.HUVECs在高剪切力作用下,随着时间的延长,自噬形成标记物LC3II/LC3I的表达量较HSS 0min时明显增加,其中在HSS 15min时增加最明显(P<0.05 vs.HSS0min,P<0.05vs.HSS15min),而自噬障碍标记物P62则随着时间延长呈现先增加后减少的趋势,并在HSS30min时达到最高水平(P<0.05 vs.HSS0min,P<0.05 vs.HSS30min)。2.自噬晚期抑制剂巴弗洛霉素A1预处理的实验组与其他两组相比,自噬形成标记物LC3II/LC3I及自噬障碍标记物p62的水平都明显升高(P<0.05 vs.HSS0min、HSS60min)。3.较无剪切力的阴性对照组,高剪切力可使P53蛋白的表达量上调,且不同剪切力作用下P53靶基因Sesn1的转录水平了发生明显改变,表现为低剪切力抑制Sesn1转录水平而高剪切力促使Sesn1转录水平上调(P<0.05 vs.0SS)。4.P53抑制剂Pifithrin-α可以阻断高剪切力下的自噬流,实验结果表现为Pifithrin-α预处理组较单纯的高剪切力处理组,自噬形成标记物LC3II/LC3I表达量无明显差异,但自噬障碍标记物p62的表达量明显上调(P<0.05 vs.HSS60min)。结论:高剪切力作用下人脐静脉内皮细胞的自噬被激活且自噬流通畅,该现象的产生与P53通路的激活有关。
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