大豆是我国主要作物之一,而根腐病是大豆种植和生产中的一种毁灭性病害,会造成严重的经济损失,严重危害大豆生产安全。大豆疫霉Phytophthora sojae是引致大豆根腐病的主要病原菌,目前生产中筛选利用抗病品种是一种主要的病害防控方式。因此,研究大豆在被侵染过程中的免疫反应,寻找稳定、广谱的抗性资源对病害防控具有重要意义。另一方面,效应分子是大豆疫霉的关键致病因子,相关基因快速变异,单一抗病品种很容易被疫霉菌克服,因此对于大豆疫霉效应分子致病机制的研究也至关重要。本研究通过分析大豆疫霉效应分子PsAvh240过表达后植物的质谱分析,发现了一个对植物抗病有重要作用的免疫相关蛋白,即大豆天冬氨酸蛋白酶GmAP1。此外,在预测了大豆疫霉所有效应分子的等电点后,发现一个较为特殊的低等电点效应分子PsAvh109。本研究就大豆天冬氨酸蛋白酶的功能和大豆疫霉效应分子PsAvh109在侵染过程中的毒性作用进行分析。大豆天冬氨酸蛋白酶GmAP1参与对疫霉菌抗病的功能分析:本研究在实验室前期研究的基础上发现过表达大豆疫霉效应分子PsAvh240提高了辣椒疫霉侵染本氏烟的能力,对过表达了 PsAvh240的烟草叶片进行质谱分析,发现了在大豆抗逆境胁迫过程中具有重要作用的蛋白大豆天冬氨酸蛋白酶GmAP1。本氏烟过表达GmAP1蛋白可以提高烟草叶片抵抗辣椒疫霉侵染的能力,利用原核蛋白表达系统表达GmAP1后检测酶活,发现其具有蛋白酶活性,而突变了 GmAP1的酶活位点后则丧失了这种作用。利用真核蛋白表达系统表达GmAP1后进行检测,前期能够检测到蛋白后期发现蛋白降解,结果表明GmAP1作为大豆外泌蛋白,在细胞内合成后进行加工形成蛋白酶前体,而后分泌到胞间两端降解留下关键酶活性位点发挥蛋白水解酶功能,促进细胞免疫反应。大豆疫霉RxLR效应分子PsAvh109的毒性功能分析:在对大豆疫霉所有效应分子的等电点进行统计后,发现一个较为特殊的低等电点效应分子PsAvh109。序列多态性分析显示Avh109在其他四个疫霉基因组中均含有同源基因,表明PsAvh109可能是疫霉基因组中一个高度保守的毒性因子。利用CRISPR/Cas9技术敲除了大豆疫霉中的PsAvh109基因后,发现大豆疫霉的致病力显著下降,表明Avh109是大豆疫霉发挥毒性所必需的效应分子。在烟草细胞中过表达PsAvh109能够促进辣椒疫霉侵染,在大豆毛状根中过表达PsAvh109基因也能够促进大豆疫霉侵染,进一步说明了 PsAvh109在大豆疫霉发挥毒性过程中具有重要作用。在进行大豆毛状根转化后,将受侵染根毛进行转录测序,通过RNA-seq技术分析差异表达基因。结果显示,过表达PsAvh109的根毛与对照组相比有819个基因发生差异表达,其中341个基因上调表达,478个基因下调表达,说明PsAvh109能够操纵寄主植物基因的表达。对差异基因进行KEGG富集分析,发现参与到植物抵抗病原菌侵染的防卫基因被大量富集。深入分析植物与病原微生物互作的所有差异表达基因,发现PsAvh109能够操控植物细胞防卫相关基因下调表达,降低植物免疫,从而发挥其毒性功能,达到成功侵染的目的。分析这些差异基因有助于深入研究病原微生物操控植物防卫基因表达的机制,为后续寻找PsAvh109的候选互作蛋白提供依据。