目的:铁皮石斛(Dendrobium off icinal Kimura et Migo)为兰科石斛属多年生草本,具有益胃生津,滋阴清热的功效。铁皮石斛以新鲜或干燥的茎入药,为药食两用的名贵中药材,野生资源分布在广东、福建、安徽、浙江、广西、云南等地区的阴湿、温暖的环境中。野生铁皮石斛越来越少,随需求量的不断增大,铁皮石斛人工栽培面积不断扩大,高度集约化的种植,加之通风不畅,生长环境普遍高温、高湿,成为多种有害病菌的温床。近年来,人工种植铁皮石斛病害有逐年加重的趋势,且不易治理,损失较大。目前除了大量喷洒化学药物,尚无高效的防治办法,病害防治成为铁皮石斛种植产业中关键的一环,若要高效快速防治病害的发生必须先了解其病原物,才能提出相应的高效易行的防治措施。因此,本研究综合形态特征、培养性状、IlluminaHiSeq高通量测序及生物信息学分析确定铁皮石斛病原物种,并系统研究其物种的生物学特性,为病害防治提供依据;同时深入研究铁皮石斛感染炭疽病后的代谢组学与蛋白组学,探讨与病害相关的代谢物、蛋白质及其可能的作用机理,为铁皮石斛抗病品种创制或选育提供理论支持。方法:本研究通过建立铁皮石斛病原菌分离鉴定体系,并系统研究铁皮石斛炭疽病病原的生物学特性,感染炭疽病后的代谢组学与蛋白质组学,探讨有关病程的代谢物、蛋白质及其分子机制。具体工作包括:1.铁皮石斛病原菌分离鉴定体系的建立:从铁皮石斛炭疽病叶中分离纯化的菌株,经致病性测定表明为铁皮石斛病原菌,采用观察病害症状、培养性状、形态学特征、Illumina HiSeq高通量测序及生物信息学分析手段确定病原菌物种;2.根据铁皮石斛病样分离纯化鉴定的结果,选炭疽菌的代表性菌株,研究不同因素对其生物学特性的影响;3.采集经胶孢炭疽菌处理的感病铁皮石斛叶片,经样本前处理、GC/MS分析、生物信息学分析等找出差异代谢物,初步探讨参与病害的差异代谢物及代谢通路分析;4.采集经胶孢炭疽菌处理后铁皮石斛感病叶片,经样品制备、蛋白定量、SDS-PAGE电泳样品的检测、蛋白还原烷基化及酶解、反相色谱分离、蛋白鉴定、生物信息学分析等找出差异蛋白质,初步探讨参与病害过程的蛋白质及其作用机理。结果:1.铁皮石斛病原菌分离鉴定体系的建立:综合铁皮石斛病原真菌的培养性状、形态学特征、致病性测定、Illumina HiSeq高通量测序分析及全基因组进化树将各代表菌株分别鉴定为白纹羽病菌或褐座坚壳菌(Rosellinia necatrix)、R.necatrix、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、Diaporthe ampelina、Podospora anserina、围小丛壳菌(Glomerella cingulata)、菜豆壳球孢(Macrophominaphaseolina)、D.ampelina。DFW07-B菌株未能确定物种,但是否为新物种尚不能确定,有待进一步的研究。其中,白纹羽病菌或褐座坚壳菌(R.necatrix)、D.ampelina、P.anserina、围小丛壳菌(G.cingulata)、菜豆壳球孢(M.phaseolina)为铁皮石斛病原真菌的新纪录种。2.铁皮石斛病原菌生物学特性分析:铁皮石斛胶孢炭疽菌在PDA、PSA培养基上较适宜菌丝生长并促进分生孢子的产生;菌丝在10～35℃下均可生长,20～30℃下菌丝浓密且生长速度快,20℃时最利于产生分生孢子;pH 5～12条件下菌丝均可以生长,最适宜产生分生孢子的pH为7;菌丝在光照条件下生长速度快,黑暗下益于产生孢子;以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖为碳源的培养基宜于菌丝生长,可溶性淀粉最益于产生分生孢子;蛋白胨是最利于菌丝浓密生长及产生分生孢子的氮源;菌丝与分生孢子的致死温度均为55℃。铁皮石斛围小丛壳菌在PDA上较适宜生长;28℃时菌丝最浓密、生长最快,子囊壳产量也最高;光照可促进子囊壳的产生;pH 8时菌丝生长最快,pH 9时子囊壳产量最高;山梨醇对菌丝的生长最有利,在麦芽糖碳源上菌丝浓密,子囊壳的产量达到最高;菌丝对蛋白胨氮源的利用率最高。菌丝体的水浴致死条件是50℃。3.铁皮石斛与胶孢炭疽病互作代谢组学分析:成功建立了各分析组的多维统计分析模型,并结合单维统计分析,从鉴定出的305个代谢物共筛选出84个差异代谢产物。感病材料含有除亚氨基二乙酸(iminodiacetic acid)外的83种差异代谢物,且其中的36种为感病组特有的代谢物,其余的47种代谢物中绝大多数在感病材料中的含量呈不同程度的上升趋势,而下调的仅有4种。可能与病程相关的代谢物有海因、亚精胺、熊果苷、海藻糖-6-磷酸、马尿酸、儿茶酚、草酸等,其中酒石酸、丙二酸、儿茶酚有加重铁皮石斛病情的趋势,有待进一步分析研究。4.铁皮石斛与胶孢炭疽病互作的蛋白质组学分析:成功建立了 iTRAQ技术分析铁皮石斛感病组-正常组蛋白组学体系,共鉴定3956个蛋白,可信蛋白数为2246个,筛选出133个感病组-正常组差异表达蛋白,其中表达上调蛋白67个,而表达下调蛋白有66个。GO功能分类及其富集表明这些差异蛋白主要参与转运活性、催化活性和酶调控活性,KEGG通路显著性富集于代谢途径、次生代谢产物生物合成、碳代谢、内质网蛋白质加工、乙醛酸盐代谢、光合作用、光合生物中的碳固定等。并找出与病程相关的热休克蛋白70、蔗糖合酶、抗真菌蛋白、叶绿素a/b结合蛋白等,为蛋白水平研究铁皮石斛病害及培育抗病品种提供依据。结论:以感病的铁皮石斛叶片为试验材料,基于IlluminaHiSeq高通量测序技术建立了铁皮石斛病原菌分离鉴定体系,鉴定出6种病原真菌,其中5种为铁皮石斛病原菌新纪录种。本研究首次对铁皮石斛病原真菌基因组进行了分析,为铁皮石斛病害防治的生物学研究提供宝贵的基因组数据。对铁皮石斛炭疽菌进行了较为全面的生物学特性研究,为铁皮石斛炭疽病害的防治提供参考。分别基于GC/MS、iTRAQ技术对不同处理组(感病组与正常组)的铁皮石斛叶片样本进行了代谢组学、蛋白组学分析,并找出与病害相关的代谢物与蛋白质,为分子水平研究铁皮石斛病害及培育抗病品种奠定基础。