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藓羽藻是一种多核单细胞海洋绿藻,其原生质体可在海水中发育成为新的个体因此,如果将表达质粒与其原生质体共团聚,则有可能获得携带外源基因的藓羽藻植株。若外源基因整合到藓羽藻染色体就可能很容易地得到转基因藻体。本研究利用藓羽藻原生质体作为外源基因的受体和表达系统,以农业转基因工程中常用的农杆菌Ti质粒作为载体将外源基因转入海藻,试图建立了一种可供选择的藻类基因重组系统。主要研究内容如下1.筛选藓羽藻原生质体团聚过程中活跃表达的基因区段,作为外源基因插入的潜在位点。我们发现藓羽藻中一种凝集素基因在其原生质体团聚过程中起重要作用,利用荧光定量PCR技术对其转录水平,免疫印迹法在蛋白水平上进行了检测,证明其在原生质团聚及发育过程中存在一个先增加后降低的过程。免疫胶体金定位试验结果说明此凝集素在藓羽藻细胞内含量丰富,它既存在于胞质中,也存在于叶绿体的类囊体膜内。推测凝集素能促进原生质体中细胞器的团聚与再生2.采用染色体步移技术获得了凝集素基因的侧翼序列,并在5’非翻译区发现了一段强启动子序列。以凝集素基因、GFP检测基因、凝集素基因3’与5’端各一段非翻译区段作为元件,按照不同的排列次序,将这几种元件组装入pCAMBIA3301质粒,分别构建了四种Ti质粒p3301SLec5’G3’UTR,p3301SGFP, p3301SGFP5’-3’UTR, p3301SGFP5’S3’UTR,经大肠杆菌扩增后,分别回收质粒转入农杆菌。3.培养包含Ti质粒的农杆菌菌株EHA105和LBA4404至OD600=0.3,左右,加入乙酰丁香酮诱导,参考上述藓羽藻原生质团聚体形成及发育过程中凝集素表达变化的结果,在原生质团聚时,加入乙酰丁香酮诱导处理的农杆菌,待团聚体形成6小时至12小时内,每隔1小时,用乙酰丁香酮诱导15分钟的农杆菌处理团聚球10分钟,之后换海水培养原生质团聚球。待原生质体发育成小苗后,荧光显微镜观察新长出的植株,但未监测到绿色荧光蛋白的表达。后提取DNA,以GFP基因设计引物,进行分子鉴定,可惜的是也没有监测到GFP的基因片断,说明GFP基因没有整合到藓羽藻基因组,并不是整合以后的表达沉默。