论文部分内容阅读
银黑狐和蓝狐杂交属于属间远缘杂交,杂交一代银霜狐(蓝狐♂×银黑狐♀,HBS)和蓝霜狐(银黑狐♂×蓝狐♀,HSB)公狐表现为完全或部分不育,不能产生精子。近年来,转录组学技术被应用于马和驴杂交、黄牛和牦牛远缘杂交雄性不育,筛选得到调控精子发生的关键基因。本研究利用准备配种期和配种期银黑狐、蓝狐和银霜狐、蓝霜狐公狐作为试验材料,通过比较分析正常可育的银黑狐、蓝狐,以及不育的杂交狐精液品质、血清激素水平和睾丸、附睾的组织形态学差异,寻找杂交狐雄性不育的可能原因。以准备配种期和配种期银黑狐、蓝狐、杂交狐的睾丸组织为研究对象,采用转录组测序技术,建立银黑狐、蓝狐、杂交狐的转录组数据库,针对4种狐狸2个不同发育时期、同一发育时期4种不同的狐狸之间进行差异基因分析,筛选杂交狐和银黑狐、蓝狐调控精子发生过程的差异表达基因,确定精子发生关键基因,揭示杂交狐雄性不育的生理学差异和分子调控机制。结果表明配种期银黑狐、蓝狐、银霜狐和蓝霜狐的单次射精量之间差异不显著(P>0.05)。银黑狐和蓝狐精液中存在大量精子,两种杂交狐银霜狐和蓝霜狐精液中没有精子存在,杂交狐精子发生过程停滞。银霜狐和蓝霜狐生精细胞由初级精母细胞阶段向次级精母细胞阶段发育的过程发生了障碍,精子发生过程停滞在次级精母细胞阶段。准备配种期银霜狐和蓝霜狐低浓度的睾酮和雌二醇,高浓度的FSH、LH和PRL引起睾丸和生精小管发育不完全。配种期银霜狐和蓝霜狐低浓度的睾酮,高浓度的LH和PRL引起睾丸和生精小管发育不完全,导致杂交狐生精过程障碍,进而导致不育。对4种狐狸准备配种期和配种期睾丸组织进行高通量测序及序列组装,共获得Clean bases175.36G,1142703819条Transcripts,673146243条Unigenes,建立了较为全面的狐狸睾丸转录组数据库,与NR、NT、SwissProt数据库注释比对,分别注释了76243、276899、56851条Unigenes。对转录组测序获得的差异基因进行分析,将4种狐狸同一个发育时期以及同一种狐狸准备配种期和配种期比较发现,筛选到调控精子发生的差异基因有151个。进一步分析发现,有26个基因主要在第一次减数分裂由初级精母细胞向次级精母细胞发育阶段发挥作用,这26个基因分别是ASPM,BAG6,BRDT,CCNA1,DDX4,GGN,GGNBP2,GMCL1,HSF2,HSF2BP,KHDRBS3,MAEL,MAK,MEIG1,MLH1,MNS1,NDRG3,PACRG,PAFAH1B1,PGAM2,RAD51C,SCMH1,SOX30,SUN5,TDRD9和TEX15。还有两个基因对于精子发生很重要,KATNAL1基因于睾丸支持细胞特异表达,ACSBG2基因于睾丸间质细胞特异表达。对18个差异表达基因进行荧光定量PCR验证发现,差异基因荧光定量PCR表达趋势与转录组测序结果基本一致,说明转录组测序结果基本反映了杂交狐和银黑狐、蓝狐睾丸中基因真实的表达水平。综上所述,银黑狐和蓝狐杂交一代银霜狐和蓝霜狐精子发生过程停滞在初级精母细胞向次级精母细胞发育阶段,筛选得到的28个基因可以作为后续研究银黑狐和蓝狐杂交雄性不育机制的候选关键基因。而这28个基因在银霜狐和蓝霜狐精子发生过程中的具体功能和相互作用关系有待于进一步验证。本研究获得的研究结果对系统研究杂交狐雄性不育的分子机制奠定了基础。