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背景与目的:水蛭有超过100种不同的生物活性物质,这些活性物质具有多种药用功效。水蛭活体疗法是利用水蛭的吸血功能促进血液循环,同时通过水蛭在吸血过程中所释放的具有抗凝血功能的活性物质清除组织中淤积的血液,增加组织的灌流量,因此水蛭活体疗法作为一种辅助医疗手段常常被用于现代医学中的各种领域。但是水蛭活体疗法过程中由水蛭细菌引起的感染仍然是目前主要关注的问题,而国内外至今也没有明确的医用吸血水蛭的洁净养殖技术,也没有预防水蛭活体疗法的细菌感染的指南。菲牛蛭（Poecilobdella manillensis Lesson,1842）是我国和许多东南亚国家广泛使用的活体疗法水蛭品种,为了降低菲牛蛭活体疗法的细菌感染风险,本论文研究了医用菲牛蛭的洁净养殖及处理技术,旨在通过人工饲养和消毒处理最大程度减少菲牛蛭自身携带的病原菌,同时测定了菲牛蛭消化道内细菌的药物敏感性。本研究对医用水蛭的洁净养殖和临床上预防水蛭活体疗法引起的细菌感染具有指导意义。方法:1.人工饲料的配制试验通过配制不同比例的血浆蛋白和血球蛋白（1:0、6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6和0:1）的9组等氮饲料（饲料粗蛋白质含量为21%,接近哺乳动物血液蛋白含量）,以新鲜血液为对照,对菲牛蛭进行为期31天的饲养,探究不同蛋白配比的饲料对菲牛蛭生长的影响。从菲牛蛭的存活率、增重率和特定生长率三个方面对不同蛋白配比的人工饲料做出评价,并确定一种较优的无病原微生物的人工饲料配方来替代传统血液饲养。2.禁食期菲牛蛭消化道菌群测定使用高通量测序技术和生物信息软件分析来探究不同禁食时间（7天,45天,120天）对菲牛蛭消化道（嗉囊和肠道）菌群的影响,以评估通过禁食降低细菌感染率的可行性。3.菲牛蛭体表消毒方法采用半静水生物毒性测试法研究了苯扎溴铵、高锰酸钾、聚维酮碘对菲牛蛭的急性毒性,通过检测菲牛蛭经不同浓度消毒剂处理后的体表细菌总数和测试处理后的菲牛蛭吮吸能力,确定医用菲牛蛭使用前的体表消毒试剂和消毒方法。4.菲牛蛭消化道内细菌的分离鉴定及其药物敏感性采用传统有氧培养法对菲牛蛭消化道内细菌进行分离纯化,并对分离株进行形态观察、生化鉴定以及16S rRNA基因序列分析,采用K-B纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer disc agar diffusion test）检测了分离株对1 1种临床常用抗菌药物的敏感性。结果:1.用于活体疗法的医用菲牛蛭的人工饲料配方当饲料中粗蛋白质含量为21%时,血浆蛋白和血球蛋白的不同配比对菲牛蛭的增重率和特定生长率有显著影响,对存活率没有影响。添加复配的蛋白粉饲料组（6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4和1:6）与添加单一的蛋白粉饲料组（0:1、1:0）相比,能显著提高菲牛蛭的增重率和特定生长率（p＜0.05）,当饲料中血浆蛋白和血球蛋白的比例为1:4时,菲牛蛭的增重率和特定生长率达到最大值,与血液喂养的对照组相比差异不显著（p＞0.05）,说明添加了该蛋白配比的饲料（即血浆蛋白粉为4.66%,血球蛋白粉为22.19%）可以获得与饲喂血液相当的存活率、增重率和特定生长率,因此以4.66%的血浆蛋白粉,22.19%的血球蛋白粉,0.9%的氯化钠、0.21%的L-精氨酸盐和0.05%的VC和71.99%的蒸馏水配制成菲牛蛭的无病原微生物人工饲料配方,可以将其作为替代传统血液的人工配合饲料,在减少病原微生物摄入的同时能够保证菲牛蛭的生长发育。2.禁食对菲牛蛭消化道菌群的影响α多样性分析结果显示,不同禁食时间组（喂食后禁食7天,45天,120天）的菲牛蛭消化道菌群的物种丰富度和物种多样性差异均显著（p＜0.05）,在禁食45天时,菲牛蛭消化道菌群丰富度和多样性最低。PCoA分析和ANOSIM分析结果显示:不同禁食时间组之间,菲牛蛭消化道的菌群整体结构差异显著（p＜0.05）。在门水平上,在禁食7天,45天,120天时菲牛蛭消化道（嗉囊和肠道）的菌群均以变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）为优势菌,三个门的细菌总数占据了91%以上。变形菌门在禁食45天组相对丰度最少,而拟杆菌门在禁食45天组相对丰度最高,厚壁菌门随禁食时间增加而逐渐减少,120天组相对丰度只有0.22%。在属水平上,菲牛蛭消化道内嗉囊（crop）的优势菌在禁食7天组（F7d）为气单胞菌属（Aeromonas）和Mucinivorans属,在肠道（intestine）的优势菌为 Mucinivorans属、unculturedbacteriumfElsteraceae 和气单胞菌属;禁食 45天组（F45d）嗉囊和肠道中优势菌均为拟杆菌属（Bacteroides）;120天组（F120d）嗉囊和肠道优势菌均为Elstera属和unculturedfElsteraceae。气单胞菌属在嗉囊和肠道的相对丰度随禁食时间增加而逐渐减少（嗉囊:F7d（38.23%）＞F45d（0.57%）＞F120d（0.04%）;肠道:F7d（11.92%）＞F45d（0.7%）＞F120d（0.02%））;Mucinivorans属也随着禁食时间的延长,呈现逐渐减少的变化趋势（嗉囊:F7d（20.41%）＞F45d（3.94%）＞F120d（0.20%）,肠道:F7d（20.81%）＞F45d（1.6%）＞F120d（0.07%））,而Bacteroides属在禁食45天时相对丰度达到最高,在禁食45天后,也随着禁食时间的延长,呈现逐渐减少的变化趋势（嗉囊:F7d（0.07%）＜F45d（60.11%）＞F120d（0.48%）;肠道:F7d（0.18%）＜F45d（64.73%）＞F120d（0.02%））。三种消化道细菌在禁食45天后都在逐渐减少,在禁食120天时这三种菌几乎达到不可检测水平。因此,在门水平和属水平,禁食可以改变菲牛蛭消化道优势菌群的组成和整体结构,禁食45天后菲牛蛭消化道内常见病原菌的丰度显著降低。3.菲牛蛭体表消毒苯扎溴铵、聚维酮碘和高锰酸钾在试验24h时的半致死浓度LC50分别为29.53mg/L,14.37mg/L,5.54mg/L;在48h时分别为:24.54mg/L,10.95mg/L,4.36mg/L;在72h时分别为:13.11mg/L,8.68mg/L,3.29mg/L;在96h时分别为:10.17mg/L,6.34mg/L,2.75mg/L,安全浓度SC分别为:5.08mg/L,1.91mg/L,0.81mg/L,因此三种消毒剂对菲牛蛭的急性毒性由大到小依次为:高锰酸钾＞聚维酮碘＞苯扎溴铵。使用100mg/L的苯扎溴铵溶液对菲牛蛭体表消毒5min,可以使菲牛蛭体表的细菌降低至不可检测的水平,并且不会伤害其吮吸能力。4.菲牛蛭消化道内细菌的分离鉴定及其药物敏感性从菲牛蛭消化道内共分离到84株细菌,其中气单胞菌（Aeromonas）41株（包括22株嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophilia,19株维氏气单胞菌Aeromonas veronii）;摩氏摩根菌（Morgannell morganii）19株、产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）15 株,醋 酸 钙 不 动 杆 菌（Acinetobacter calcoaceticus）9株。气单胞菌和摩氏摩根菌对第三代头孢菌素（头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松）高度敏感,产吲哚金黄杆菌和醋酸钙不动杆菌对氟喹诺酮类药物（左氧氟沙星、环丙沙星）高度敏感,分离菌对其他的抗菌药物均有不同程度的耐药性。结论:用于活体疗法的菲牛蛭的洁净养殖通过人工饲料替代血液饲喂,禁食45天以上,体表用苯扎溴铵消毒,可以显著减少菲牛蛭所带病原菌。在临床上将第三代头孢菌素（头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松）和氟诺酮类药物（左氧氟沙星、环丙沙星）作为预防菲牛蛭活体疗法出现的细菌感染的首选药物。