环境温度和湿度的相互作用对热带和亚热带地区奶牛的生产性能和繁殖过程会产生不利影响。而热应激已成为影响动物生产性能的主要问题之一。泌乳奶牛由于其泌乳期间产生过高的代谢热从而更容易受到热应激的影响。热休克蛋白是一种高度保守的具有分子伴侣活性的蛋白质超家族,热应激期间,在动物体内广泛表达。在热休克蛋白家族中,HSP7A1A和HSP90AA1是真核细胞中最丰富的蛋白质,被认为是泌乳奶牛热应激最重要的指标。在中国荷斯坦奶牛中,特定热休克蛋白基因中的单核苷酸多态性（SNP）可能与耐热性和热调控相关。因此,热休克蛋白家族基因可以作为奶牛抗热应激育种的候选基因。然而,很少有研究表明HSP7A1A和HSP90AA1基因的SNPs与中国荷斯坦奶牛的耐热性之间存在关联。因此,本研究通过对HSP7A1A和HSP90AA1基因测序获得SNP位点信息,分析其基因多态与奶牛产奶量和体细胞数表型之间的相关性,旨在确定HSP7A1A和HSP90AA1基因中的多态性是否会影响耐热性。此外,本研究还探讨了 FOX03a基因在调控牛乳腺上皮细胞热休克蛋白基因中的作用,研究进行如下:1.中国荷斯坦奶牛HSP70A1A基因多态性与耐热相关的功能分析温湿度的升高使得泌乳奶牛的奶产量和乳品质下降是乳制品生产中存在的重要问题之一。本研究的第一个目的是鉴定HSP7A1A基因中可能与热应激和热调控相关的新型SNPs。第二个目的是验证中国荷斯坦奶牛中HSP7A1A基因单核苷酸多态性（SNPs）与耐热性之间的关系。因此,实验选取146头经产奶牛来研究HSP7A1A与耐热性之间的关系。采用直接测序的方法,在HSP7A1A中鉴定出4个SNPs,其中启动子区域的2个SNPs是新型的,并且在本研究中首次报道。荧光素酶报告基因检测方法结果显示g.-133（突变体）中的GG基因型比CC基因型（野生型）明显增加了启动子活性。采用DNAStar Protean软件检测HSP7A1A蛋白的亲水性和二级结构。利用Hopp-Woods,Gamier及相关的在线同源建模方法构建HSP7A1A蛋白的三维结构。结果发现编码区中的两个SNPs会改变氨基酸序列并影响产奶量和体细胞数（SCC）。这两个 SNPs g.462G/T 和 g.1877G/C,分别引起 HSP70A1A 蛋白154Gln→His和626Gly→Ala氨基酸序列的变化。此外,626Gly→Ala影响了HSP70A1A蛋白的二级结构。通过测量不同季节或温湿指数[即非热应激季节（3月）和热应激季节（7月）]下泌乳奶牛的产奶量和体细胞数（SCC）,评估其耐热性。这一结果表明HSP7A1A基因的多态性可能影响耐热性,并可作为热调控的分子标志物。因此,本研究可有助于筛选出中国荷斯坦奶牛选育耐热牛群的分子遗传标记。2.中国荷斯坦奶牛热休克蛋白90AA1基因多态性与耐热性的关联分析热休克蛋白90（HSP90）是一种广泛分布的分子伴侣蛋白,在许多细胞生物过程中起着重要作用。本研究的目的是鉴定HSP90AA1基因中的单核苷酸多态性（SNPs）,并确定其基因多态与中国荷斯坦奶牛热应激性状的关联。采用直接测序鉴定新的SNPs。采用荧光素酶报告基因测定法分别评估g.-87G>C和g.4172A>G位点在启动子活性和3’-UTR中的作用。采用实时荧光定量PCR来测定基因mRNA表达量。结果显示,在130头经产奶牛中鉴定出5个SNPs:启动子区有1个SNP,编码区有3个SNPs,3’-UTR中的1个SNP是新发现的,并在本研究中首次报道。采用双萤光素酶报告基因检测启动子活性,结果表明,与野生型GG（3.24±0.103）相比,基因型CC显示出较高的转录活性（13.67±0.578）。另一方面,实验中筛选出的一种 microRNA（dme-miR-2279-5p）,其可以与 HSP90AA1 3-UTR序列相互作用并在等位基因G显着抑制启动子活性（2.480±0.136）。在热应激季节,奶牛HSP90AA1的表达中突变等位基因C（4.18±0.928）明显高于野生型等位基因G（1.008±0.0129）。总之,HSP90AA1的遗传变异与耐热性之间存在关联。这种关联可以为中国荷斯坦奶牛的耐热性选择提供分子遗传标记。3.FOX03在调控奶牛乳腺上皮细胞HSP7A1A和HSP90AA1基因mRNA表达中的作用转录因子FOX03a是叉头框转录因子家族的成员,参与许多重要的细胞生理过程。本研究旨在探讨FOX03a基因在调控牛乳腺上皮细胞热休克蛋白基因中的作用。为了鉴定FOX03a基因在调控HSP7A1A和HSP90AA1基因中的作用,使用DMEM/F-12培养基在37℃条件下体外培养奶牛乳腺上皮细胞。在第一个实验中,将细胞分为五组,对照组和四个热应激组。在第二个实验中,我们使用化学抑制剂LY294002（10μmol/L）抑制 PI3K/Akt 通路,从而观察 FOX03a 和 HSP70A1A 的蛋白表达变化。细胞分为六组:对照组,两个热应激组,抑制剂组,最后两组为热应激+抑制剂处理组。在第一个实验中分别热处理Oh,2h,4h和8h,第二个实验分别热处理4h、8h后,提取细胞总的mRNA和蛋白质。基因表达结果显示,与对照组相比,热处理8小时后,FOX03a的mRNA表达水平显著升高（3.806±0.243）。而HSP7A1A和HSP90AA1的表达随着恢复时间的延长而逐渐增加,与基础对照组相比,热处理8小时后,HSP7A1A（2.331±0.189）和 HSP90AA1（6.134±0.777）的基因表达显著升高。第一个实验的蛋白质印迹结果显示,与对照组相比,FOX03a（1.545±0.162）、HSP7A1A（1.617±0.039）和 HSP90AA1（1.898±0.266）的蛋白表达在热处理8小时后显著增加。此外,在第二个实验中,蛋白质印迹结果显示,与单纯热应激组相比,在抑制剂LY294002（10μmol/L）处理的细胞组中,奶牛乳腺上皮细胞中FOX03a（0.494±0.011）和HSP7A1A（0.529±0.021）的蛋白表达在同样热处理8小时后显著降低。总之,转录因子FOX03a基因会对热应激作出应答,从而过表达奶牛乳腺上皮细胞中的HSP70A1A和HSP90AA1。依据这个结果,我们推测FOX03a基因可能有助于调控热休克蛋白的表达。