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杉木是我国重要的速生用材树种,土壤有效磷不足是影响杉木人工林产量的重要因素,杉木在长期适应低磷环境中形成了响应低磷胁迫的内在机制,因此筛选磷高效利用杉木基因型是解决林地土壤有效磷不足的重要方向。对拟南芥、水稻等模式植物的研究表明PHR1转录因子处于植物磷信号调控网络的中心位置,调控着一系列磷转运蛋白、microRNA和转录因子等低磷胁迫相关基因的功能表达,研究PHR1基因的功能和序列特征对于解析植物低磷胁迫响应机制具有重要现实意义。但目前还未见有关杉木响应低磷胁迫的关键转录因子PHR1的研究报道,而这又是揭示杉木适应低磷胁迫调控机制的关键。有鉴于此,本论文以导师课题组前期研究筛选出的杉木磷高效利用无性系M32为试验材料,利用RACE全长克隆技术获取杉木ClPHR1转录因子的全长序列,分析ClPHR1基因编码蛋白的结构特.征、功能特性和亚细胞定位,解析低磷胁迫下杉木ClPHR1转录因子的时空表达特征,获得过量表达ClPHR1基因的转基因拟南芥株系,验证低磷胁迫下转拟南芥ClPHR1基因的基因功能。为探讨杉木ClPHR1转录因子的序列特征和功能特性,揭示杉木对低磷胁迫的响应调控机制,筛选磷高效利用杉木种质资源提供科学依据。主要研究结果如下:1、以已知PHR1保守序列为基础,利用序列相似性原则,通过RACE全长克隆技术获取杉木ClPHR1基因全长序列。该基因全长1954bp,其中开放阅读框1512bp,编码一个含有503个氨基酸的蛋白,编码蛋白的理论分子量为55.40kDa,预测为不稳定的亲水蛋白;该蛋白无信号肽仅可能存在一个跨膜区域。与其他植物的PHR1基因相同,杉木ClPHR1基因具有高度保守的MYB-CC结构域,是属于MYB-CC转录因子家族的新成员,系统进化树分析发现其序列与芝麻SiPHR1和无油樟AmPHR1具有较高的同源性。2、对杉木不同组织部位的稳定内参基因进行筛选研究表明:geNorm、Normfinder和BestKeeper软件分析均显示在杉木根和茎中最稳定的内参基因是EFla和Actin;geNorm、Normfinder分析显示杉木叶中稳定的内参基因是UBQ和EFla,BestKeeper显示杉木叶中最稳定合适内参基因是EFla和Actin。以不同内参基因作为试验内参基因,分析杉木纤维素酶合成基因ClCesA1和ClCesA2的表达情况,结果显示ClCesA1和ClCesA2在杉木中的相对表达量排序为茎>叶>根;7个候选内参基因中,杉木不同组织中稳定表达的为Actin与EFla,适合作为杉木表达分析的内参基因。3、ClPHR1基因在杉木各个组织中均有表达,在根中的表达量最高,叶次之,茎最低。在低磷和无磷培养条件下,培养1-7 d的杉木根中ClPHR1基因表达量均低于对照杉木;在低磷条件下茎与叶中ClPHR1基因的表达量在培养1 d时上升,3 d时下降,7 d时表达量又上升,特别是茎中ClPHR1表达量变化相对明显。在无磷培养条件下,茎中ClPHRl基因的表达量均高于培养Od时,叶中的表达量同样表现为先上升后下降再上升的趋势,且变化明显。随着低磷胁迫程度的增加和胁迫时间的延长,ClPHR1基因的表达呈现出动态的变化规律。4、将目的基因ClPHR1与载体PGReenⅡ-62-SK-EGFP蛋白的N端或C端融合,构建瞬时表达的荧光载体PGReenⅡ-62-SK-PHR1-EGFP,通过瞬时转染技术,将融合的载体蛋白导入植物细胞内并牵引至细胞器中。荧光观测显示,目标基因ClPHR1的荧光信号位于细胞核,其余细胞器中均未见到荧光信号,即ClPHR1亚细胞定位于细胞核中,是一个核内表达的MYB-CC转录因子。5、设计目的基因ClPHR1与载体pCAMBIA-1300-35S-GFP相互连接的酶切位点的特异性引物,使目的基因与载体相互融合,构建出ClPHR1基因过表达载体pCAMBIA-1300-35S-PHR1-GFP。通过农杆菌侵染花序法将过表达载体导入拟南芥中,经过潮霉素抗性筛选与PCR检测,获取过表达的ClPHR1转基因拟南芥阳性植株。对过表达株系幼根中的磷转运蛋白基因的表达进行分析,在全磷培养与低磷培养条件下AtPhtl;1、AtPhtl;2、AtPhtl;8与AtPhtl;9在过表达株系中的表达量均明显高于野生型株系,AtPhtl;4和AtPhtl;5的表达量则较为接近,即 ClPHR1 基因对 AtPht1;1、AtPhtl;2、AtPhtl;8 与 AtPhtl;9的表达具有调控作用,对AtPhtl;4和AtPht1;5的表达不具有调控作用。