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青蒿素是从黄花蒿(ArtemisiaannuaL．)中提取的一种含有过氧桥基团结构的倍半萜内酯，是治疗疟疾的特效药物。但天然药源植物黄花蒿中青蒿素含量较低(0.01％～0.6％，DW)，大大限制了商业化的生产，青蒿素的产量远远不能满足国际市场的需求。化学合成青蒿素，成本高、毒性大不能应用于生产。近年来。随着青蒿素生物合成途径相关酶基因的克隆，基因工程成为提高青蒿素含量的有效途径之一。为研究青蒿素生物合成的分子机理并为青蒿素代谢工程提供靶点，本研究从黄花蒿中克隆获得了青蒿素代谢途径中的两个关键酶基因：羟甲基丁烯基-4-磷酸合成酶基因(HDS)和羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶基因(HDR)，并进行了相应的生物信息学分析和功能验证。为提高青蒿素的含量，本研究还利用基因工程手段，构建了三个植物表达载体，并将其分别转入黄花蒿中，对黄花蒿的遗传转化进行了研究分析。主要结果如下：
HDS催化2-C—甲基赤藓醇-2,4—环焦磷酸(ME—cPP)转化生成羟甲基丁烯基-4-磷酸(HMBPP)，是MEP途径中的一个必需关键酶。本研究采用RACE技术，首次从黄花蒿中克隆获得了HDS基因的cDNA全长序列，并命名为AaHDS(GenBank登录号为：FJ479720)。该基因cDNA全长2324bp，包含1854bp的开放式阅读框(ORF)，编码617个氨基酸残基的蛋白，其电子预测分子量为68.7KDa，等电点预测为5.3。生物信息学分析显示，AaHDS与来源于其他物种的HDS蛋白序列同源，尤其是与植物来源的HDS高度同源，氨基酸保守一致性高达80％-95％。AaHDS包含HDS蛋白典型的Cys-270、Cys-273、Cys-305半胱氨酸残基活性位点，这三个氨基酸残基是HDS蛋白催化区域中最保守的位点。将AaHDS与来源于植物、藻类和细菌的HDSs构建分子发育树，结果表明HDSs在进化树上按照各自所属类群分为3枝，AaHDS聚到植物的一枝，且与植物甜菊(Steviarebaudiana)HDS亲缘关系最接近。对AaHDS基因的克隆和分析将会有助于在分子水平上更好地了解HDS在青蒿素生物合成中的作用。
HDR是青蒿素前体生物合成MEP途径中的最后一个催化酶，催化HMBPP转化为异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)(5：1)的混合物。本研究采用RACE技术，首次从黄花蒿中克隆获得了HDR基因的全长cDNA，并命名为aaHDR(GenBank登录号为：GQ119345)。该基因cDNA全长1640bp，包含1368bp的ORF，编码455个氨基酸残基的蛋白，其电子预测分子量为51.3KDa，等电点预测为5.63。氨基酸序列多重比对结果表明aaHDR与来源于其他植物的HDRs具有很高的同源性，且所有比对的植物HDR都含有一段质体转运肽。对aaHDR进行构建分子发育树分析，结果表明HDRs在进化树上按照各自所属类群分为3枝，AaHDR聚到植物的一枝。AaHDR蛋白质的三级结构与超嗜热菌(Aquifexaeolicus)的HDR蛋白质的三级结构极为相似。功能验证表明，AaHDR能互补突变菌株E．coliMG1655ara◇HDR中缺失的HDR的功能，使突变菌株恢复生长，证明AaHDR具有典型的HDR的功能。对AaHDR的克隆分析与功能验证，有助于在分子遗传学水平上了解HDR的功能，并对研究青蒿素前体合成的分子机理有一定帮助，为青蒿素次生代谢工程提供一个可能的候选靶点。
鲨烯合酶(SQS)是类异戊二烯代谢途径支路上的一个关键酶。本研究利用反义抑制技术，构建SQS的反义表达载体p1304+—antSQS，调整代谢流向，使碳流从甾类途径“分流”或“截流”至青蒿素的代谢方向，从而促进青蒿素的生物合成。并将载体导入根癌农杆菌LBA4404，获得了工程菌LBA4404—p1304+—antSQS。通过农杆菌介导法，导入黄花蒿中，经PCR鉴定，获得了12株转antSQS的转基因植株。同时还研究了滤纸对黄花蒿丛生芽的诱导及在遗传转化中的应用，结果表明，在诱导培养基中都加铺一层滤纸，黄花蒿丛生芽的诱导率能得到显著提高，达到100％；在筛选培养中加铺滤纸，能提高黄花蒿抗性丛生芽的产生。这为黄花蒿的遗传转化奠定了基础。
青蒿素生物合成所需的IPP前体由MVA途径和MEP途径共同提供，已有研究报道HDR是MEP途径中的一个关键酶。为了研究HDR在青蒿素生物合成中的作用，进而阐明MEP途径在青蒿素前体合成中的作用。本研究克隆了AaHDR的编码区1368bp的片段并命名为cdsHDR和760bp的片段并命名为antHDR，分别正向和反向插入植物表达载体p1304+的CaMV35S启动子和NOS终止子之间，成功构建了AaHDR的正义植物表达载体p1304+—cdsHDR和反义植物表达载体p1304+—antHDR，并导入根癌农杆菌LBA4404，获得了相应的工程菌。通过农杆菌介导法，将p1304+—cdsHDR和p1304+—antHDR分别导入黄花蒿，经PCR筛选，分别获得17株正义和9株反义转基因植株。