表遗传学是指基于非基因序列改变所导致的基因表达水平变化，它决定了基因转录的开关及其表达方式。当人类进入后基因组时代后，尤其是人类表观基因组计划的提出和实施，表遗传学引起了越来越多的学者关注，并逐渐成为阐明基因组功能的关键研究领域之一。DNA甲基化是表遗传学的主要内容之一，也是基因表达重要的调控方式之一，它可通过基因启动子及其附近区域内CpG岛胞嘧啶的甲基化关闭某种组织或细胞不必需的基因，使之不表达或沉寂。DNMTs是催化和维持DNA甲基化的关键酶，在DNA甲基化中起着十分重要的作用。肿瘤形成是一个多因素、多基因和多途径的病理过程，其发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关。许多研究表明，抑癌基因的失活与启动子区域高甲基化有密切关系，而DNMTs的表达水平升高和活性增加被认为是引起抑癌基因启动子区域发生高甲基化的主要原因之一。在邹声泉教授的领导下，我们课题组在前期研究中应用DNMTs抑制剂5-Aza-CdR对人胆管癌细胞的生长周期进行观察，发现5-Aza-CdR可以在体内外抑制胆管癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，说明DNMTs在胆管癌的发生发展中扮演着重要的角色，也提示我们通过干预DNMTs的表达从而调控肿瘤相关基因的甲基化状态和治疗胆管癌具有潜在的意义。同时还发现，抑癌基因RASSF1A在肝外胆管癌组织中的转录表达缺失高达68.75％，明显高于其在癌旁组织中的表达缺失率，并与肝外胆管癌的淋巴转移及TNM分期相关；通过甲基化特异性PCR和DNA测序证实了启动子区域CpG岛高甲基化是RASSF1A基因表达缺失的主要机制之一。为了进一步探讨DNA甲基化与基因表达和肿瘤形成之间的关系，我们以催化DNA甲基化发生的两个甲基转移酶—DNMT1、DNMT3b和抑癌基因RASSF1A为研究靶标，通过反义RNA技术下调DNMT1和DNMT3b在人胆管癌细胞中的表达，初步研究DNMT1和DNMT3b在调控RASSF1A启动子区域甲基化状态及其表达的机制，同时观察下调DNMT1和DNMT3b的表达对人胆管癌细胞生长的生物学效应，为胆管癌的表遗传学发生机制和基因治疗提供新的理论基础和实验依据。第一部分：DNMT1、DNMT3b基因在人胆管癌中的表达及意义论文1：DNMT1和DNMT3b基因在人胆管癌组织和细胞中的表达及意义目的研究DNA甲基转移酶1（DNMT1）和DNA甲基转移酶3b（DNMT3b）在人胆管癌组织和人胆管癌细胞系QBC₉₃₉中的表达情况，并分析DNMT1和DNMT3b的表达率与胆管癌临床病理因素之间的关系，探讨二者在胆管癌发生发展过程中的作用。方法1．用免疫组织化学法检测DNMT1和DNMT3b蛋白在24例胆管癌组织和20例胆管炎组织中的阳性细胞表达率，将二者进行对比并分析其与胆管癌临床病理之间的关系；2．用RT-PCR和Western Blot分别检测DNMT1和DNMT3b基因在人胆管癌细胞系QBC₉₃₉中转录水平和蛋白水平的表达情况。结果1．在24例胆管癌组织中，DNMT1蛋白阳性细胞表达率为（37.57±11.24）％，而在20例伴慢性炎症的胆管壁组织中的阳性细胞表达率为（10.73±6.61）％，二者之间的差异具有非常显著性意义（P=0.005）；DNMT3b蛋白在胆管癌组织中的阳性细胞表达率为（46.56±12.12）％，在胆管炎组织中的表达仅为（3.34±2.73）％，其间差异亦具有非常显著性意义（P=0.000）。2．DNMT1和DNMT3b蛋白的异常表达与胆管癌组织的分化程度相关，低分化肿瘤的表达水平最高，其次为中等分化肿瘤，高分化肿瘤的表达水平较低。DNMT1和DNMT3b蛋白的异常表达与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、有无淋巴结转移和临床分期无明显关系。3．在人胆管癌细胞系QBC₉₃₉中，通过RT-PCR和Western Blot均检测到DNMT1和DNMT3b基因mRNA和蛋白的表达。结论1．在胆管癌组织中，DNMT1和DNMT3b蛋白的表达较胆管炎组织明显增加，并与肿瘤组织分化程度有关，与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、有无淋巴结转移和临床分期无明显关系，说明DNMT1和DNMT3b的高表达可能与胆管癌的发生发展有关，且可能是胆管癌发生中的一个早期分子事件。2．DNMT1和DNMT3b在人胆管癌细胞系QBC₉₃₉中存在表达。第二部分：反义DNMT1和反义DNMT3b基因真核表达载体的构建及鉴定论文2：反义DNMT1基因真核表达质粒的鉴定目的鉴定所获反义DNMT1基因真核表达质粒的正确性，为研究DNMT1基因功能提供工具和依据。方法根据所获反义DNMT1基因真核表达质粒的构建方法和图谱，用BamHⅠ和XbaⅠ进行双酶切鉴定，并以该质粒为模板进行PCR鉴定，同时以空质粒pCMV为对照。结果1．用BamHⅠ和XbaⅠ进行双酶切后，pCMV-THM切出1.1、1.2、3.9和4.7kb的4条DNA片段，与该质粒构建图谱及相关文献相符，说明所获质粒是正确的，可用于后续实验。2．以pCMV-THM为模板，用PCR扩增出代表DNMT1基因的442 bp特异性DNA条带，而以空质粒pCMV为模板则不能扩增出相应DNA条带，说明该质粒中含有人DNMT1基因的编码序列。结论通过BamHⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定和PCR鉴定，说明所获得的反义DNMT1基因真核表达质粒是正确的，可以用于后续实验。论文3：反义DNMT3b基因真核表达质粒的构建及鉴定目的构建反义DNMT3b基因真核表达质粒，为研究DNMT1基因功能提供工具。方法根据人DNMT3b基因cDNA序列中编码序列，设计PCR引物，在上下游引物5′端分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，RT-PCR从人胆管癌细胞系QBC₉₃₉中获得485bp的目的基因DNA片段，然后将该片段反向插入真核表达载体pEGFP-C1的多克隆位点，构建反义DNMT3b基因片段真核表达质粒，并用PCR、酶切法和DNA测序鉴定。结果1．将构建的反义DNMT3b基因真核表达质粒进行PCR鉴定，结果在467bp处出现一特异性DNA条带，说明重组质粒中含有DNMT3b基因序列，而空质粒对照组中没有目的条带出现。2．通过EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，重组质粒切出471bp和4.7kb两条特异性DNA条带，与目的基因片段和载体大小相符，说明反义DNMT3b基因片段已成功插入pEGFP-C1的多克隆位点。3．将DNA测序所得序列的反向互补序列与DNMT3b基因cDNA序列第1651～2117bp进行比对，结果完全相符。将测序序列到NCBI网站进行Nucleotide-nucleotide BLAST，结果提示与人DNMT3b基因的部分cDNA序列完全同源，说明克隆至pEGFP-C1多克隆位点上的DNA片段序列是正确的，可以用于后续研究。结论通过基因克隆技术，成功构建了反义DNMT3b基因真核表达质粒，为进一步研究DNMT3b基因功能提供了实验工具。第三部分：反义DNMT1和反义DNMT3b基因转染对人胆管癌细胞中RASSF1A基因的表达调控及其生物学效应论文4：DNMT1、DNMT3b基因共下调诱导人胆管癌细胞中RASSF1A基因启动子区域去甲基化及其重新表达目的观察联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达质粒对人胆管癌细胞系QBC₉₃₉中RASSF1A基因启动子区域甲基化和该基因表达的影响，初步探讨DNMT1、DNMT3b基因在DNA甲基化和基因表达调控中的作用。方法1．用不同浓度的G418对QBC₉₃₉进行适用浓度梯度测定，以最低细胞全部死亡浓度为基准，确定针对QBC₉₃₉细胞的最佳适用浓度，以便转染后进行G418筛选。2．将反义DNMT1基因和反义DNMT3b基因真核表达质粒联合转入人胆管癌细胞系QBC₉₃₉，G418筛选和荧光细胞克隆挑选得到稳定转染细胞株。3．用Western Blot检测转染前后DNMT1和DNMT3b蛋白表达变化，MS-PCR检测RASSF1A基因启动子区域甲基化状态的改变，半定量RT-PCR和Western Blot分别检测RASSF1A基因mRNA和蛋白水平的变化。结果1．通过G418的适用浓度梯度测定，确定人胆管癌细胞系QBC₉₃₉的G418最适筛选浓度是800μg／ml。2．与未转染的QBC₉₃₉细胞相比，QBC-THM和QBC-THM-DNMT3b（AS）细胞中的DNMT1蛋白表达明显减弱，而QBC-pCMV-pEGFP细胞中的DNMT1蛋白的表达未发生明显改变。QBC-DNMT3b（AS）和QBC-THM-DNMT3b（AS）细胞中的DNMT3b蛋白的表达水平也明显降低，而QBC-pCMV-pEGFP细胞中的DNMT3b蛋白的表达未发生明显改变。3．联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能使RASSF1A基因启动子区域去甲基化，而单独转染反义DNMT3b基因和联合转染空质粒pCMV和pEGFP-C1不能诱导其去甲基化。4．半定量RT-PCR显示：联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因能使RASSF1A基因mRNA表达量从不表达（0.000）分别增加到0.714±0.063和0.409±0.026（P=0.000），而单独转染反义DNMT3b基因和联合转染空质粒不能诱导其mRNA表达。5．Western Blot检测证实，联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因能使RASSF1A蛋白重新表达，其中以前者作用显著，而单独转染反义DNMT3b基因和联合转染空质粒不能诱导RASSF1A重新表达。结论1．转染反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达质粒能使人胆管癌细胞系QBC₉₃₉中DNMT1、DNMT3b蛋白表达水平降低2．同时下调DNMT1和DNMT3b在QBC₉₃₉细胞中的表达或单独下调DNMT1的表达，能使RASSF1A基因启动子区域去甲基化和诱导其重新表达，其中以前者效果显著。单独下调DNMT3b的表达对RASSF1A基因启动子区域甲基化状态及其表达没有影响。3．在DNA甲基化和相关基因的表达调控中，DNMT1起着主要作用，DNMT3b扮演着协同角色，但二者存在效应依赖关系，将其联合作用可发挥1+1＞2的增效效应。论文5：DNMT1、DNMT3b基因共下调对人胆管癌细胞的生物学效应目的观察联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达质粒对人胆管癌细胞系QBC₉₃₉体内外生长和增殖能力的影响，初步探讨DNMT1、DNMT3b基因在胆管癌发生中的作用。方法1．将构建好的反义DNMT1基因和反义DNMT3b基因真核表达质粒联合转入人胆管癌细胞系QBC₉₃₉，Western Blot检测转染前后相应蛋白表达的变化。2．用MTT法观察各组细胞生长曲线，软琼脂克隆形成试验观察其增殖能力，流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化，裸鼠皮下种植各组细胞观察成瘤情况。结果1．Western Blot检测证实转染反义基因能使相应蛋白表达水平降低。2．联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能影响QBC₉₃₉的生长曲线，使细胞增殖减慢，其中以前者为甚。3．联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因的细胞克隆形成率分别为（6.78±0.89）％和（14.86±2.13）％，明显低于对照组（P=0.000）。4．联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能影响QBC₉₃₉的细胞周期，使之阻滞于G1期，使细胞凋亡率从（1.63±0.27）％分别增加到（18.47±1.46）％和（6.19±0.78）％，（P=0.000）。5．联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能使裸鼠皮下种植成瘤的重量和体积减小，生长延缓，前者效果更为明显。在肿瘤抑制率比较中，QBC-THM-DNMT3b（AS）实验组的抑瘤率84.31％明显高于QBC-THM实验组的抑瘤率49.17％（P=0.000）。6．在上述效应检测中，联合转染空质粒和单独转染反义DNMT3b基因实验组对QBC₉₃₉细胞的生长和增殖无明显影响。结论1．通过联合转染反义DNMT1和DNMT3b基因真核表达质粒，可同时下调DNMT1和DNMT3b在QBC₉₃₉细胞中的表达，并能在体内外抑制QBC₉₃₉细胞生长，促进凋亡发生，其效果明显优于单独转染反义DNMT1基因。2．在DNA甲基化的过程中，DNMT1起着主要作用，DNMT3b扮演着协同角色，二者存在效应依赖关系，将其联合作用可发挥1+1＞2的增效效应，并可能通过甲基化途径与胆管癌的发生有关。小结本课题从表遗传学的主要内容—DNA甲基化着手，以催化甲基化发生的两个甲基转移酶—DNMT1、DNMT3b和抑癌基因RASSF1A为靶基因，通过观察二者在人胆管癌组织和细胞中的表达情况，并采用反义RNA技术下调DNMT1和DNMT3b在胆管癌细胞中的表达，初步研究了DNMT1和DNMT3b在调控RASSF1A启动子区域甲基化状态及其表达的机制，同时观察了下调DNMT1和DNMT3b表达对人胆管癌细胞生长的生物学效应。根据上述研究结果，得出以下结论和创新点：1．本课题首次研究了DNMT1和DNMT3b在胆管癌组织中的表达及其与胆管癌临床病理因素之间的关系。结果显示，DNMT1和DNMT3b在胆管癌组织中的表达明显高于胆管炎组织，并与肿瘤的分化程度有关，与有无淋巴结转移和肿瘤分期无关。在人胆管癌细胞系QBC₉₃₉中，同样存在DNMT1和DNMT3b的表达。提示DNMT1和DNMT3b的高表达可能与胆管癌的发生发展有关，且可能是胆管癌发生中的一个早期分子事件。2．通过基因克隆技术，首次成功构建了反义DNMT3b基因真核表达质粒，为研究DNMT3b基因在DNA甲基化和肿瘤相关基因调控中提供了实验工具。3．通过转染反义DNMT1和DNMT3b基因真核表达质粒，能使DNMT1和DNMT3b在QBC₉₃₉细胞中的表达水平降低，说明反义RNA技术在下调基因表达水平中是可行的。4．通过联合下调DNMT1和DNMT3b的表达水平，能使RASSF1A基因启动子区域去甲基化和诱导其重新表达，并可在体内外抑制QBC₉₃₉细胞生长，促进凋亡发生。其效果明显优于单独转染反义DNMT1基因，而单独转染反义DNMT3b基因没有上述生物学效应。上述结果提示：1)DNMT1在DNA甲基化的过程中起着主要的作用，DNMT3b扮演着次要的角色，但二者存在效应依赖关系，将其联合作用可发挥1+1＞2的增效效应；2)DNMT1和DNMT3b可通过DNA甲基化途径参与肿瘤相关基因的表达调控和肿瘤形成；3)下调DNMT1和DNMT3b的表达，可使肿瘤相关基因启动子区域去甲基化并诱导其重新表达，发挥其抑制肿瘤生长的作用，为胆管癌的基因治疗提供了一条新的表遗传学途径。