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构建国内分离的致肾盂肾炎大肠杆菌(uropathogenic E.coli, UPEC)132基因组DNA消减文库，筛选其特异性片段，并对新发现的片段获取其完整的开放读码框(open reading frame, ORF)。方法：1．以UPEC132为tester(待富集特有序列的菌株)，以完成基因组测序的非致病性E.coli K-12 MG1655为driver(扣除tester中共有序列的菌株)，应用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)技术，经过两轮消减杂交和两次抑制性PCR，选取UPEC132基因组的差异片段，进行T-A克隆，转化给E.coli Top10，在氨苄青霉素(Amp)及X-gal／IPTG筛选下，挑取白色阳性重组子，获得UPEC132基因组DNA消减文库。2．从上述DNA消减文库中随机挑选阳性重组子，经碱裂解法提取质粒DNA作为模板，经PCR筛选验证。将上述PCR产物变性后点于尼龙膜上，地高辛随机引物法分别标记UPEC132和E.coli K-12 MG1655基因组DNA作为探针，经过预杂交、杂交、DAB显色，筛选带有UPEC132特异性片段的阳性克隆子。挑选有意义的克隆株进行序列分析，所得序列结果输入GenBank，利用BLAST程序(http://www/ncbi.nlm.gov/BLASTN)查找NCBI数据库，进行相似性比对。3．选取新发现的片段，用基因组步移(Genome Walker)方法获得其5’端和3’端的序列。首先提取UPEC132基因组DNA，将其分为4组，分别用DraⅠ、EcoRⅤ、StuⅠ、PvUⅡ酶切，然后与Genome Walker接头(adaptor)连接，建立Genome Walker文库。分别以4组Genome Walker文库基因组DNA片段为模板，以接头特异性引物和新发现片段的特异性引物进行第一次LD-PCR和第二次巢式PCR，将第二次PCR产物直接进行T-A克隆，转化给E.coli Top10，其结果用Proscan(Version 1.7)软件分析，确定新发现片段的完整ORF。结果：1．应用抑制性消减杂交获得约1600个重组子的UPEC132基因组DNA消减文库。2．随机挑取其中的350个克隆，经PCR和斑点杂交筛选，挑选93个克隆测序，经生物信息学分析显示：1个UPEC132特异性SSH片段R049(789bp)与GenBank注册的UPEC菌株相关序列无相似性；39个UPEC132特异性SSH片段与GenBank注册的UPEC132菌株相关序列显示高度的相似性，其中10个为与致病相关基因序列，8个为与代谢与物质转运相关基因序列，2个为与外膜蛋白有关基因序列，3个为与调节相关基因序列，还有11个为未知功能蛋白的基因和5个其它功能未分类的基因序列。另有19个UPEC132特异性SSH片段与GenBank注册的非UPEC菌株相关序列显示高度的相似性，其中13个与其他大肠杆菌tRNA或质粒序列相关，其他6个与沙门氏菌或志贺氏菌等的序列相关。此外，有10个SSH片段重复出现，6个片段为使用的克隆载体(pMD-18T载体)的序列。所获得的UPEC132特异性SSH片段均未发现与E.coli K-12 MG1655相关的序列，表明我们获得的UPEC132基因组消减文库是成功的。将新发现的UPEC132片段，命名为R049(789bp)，提交GenBank注册，注册号为EF488001。3．以R049(789bp)为核心，用基因组步移技术双向延伸，获得R049(789bp)5’端1502 bp和3’端1207 bp。利用DNAStar 5.01软件进行序列拼接，共获得3498bp的片段，进一步利用Proscan(Version 1.7)软件分析，获得一个1311bp的可能的ORF，暂命名为R049(1311bp)。结论：本研究已成功地构建了UPEC132菌株基因组DNA消减文库，并获取了UPEC 132的特异性片段，为致肾盂肾炎大肠杆菌致病机理的深入研究奠定了良好的基础。