研究背景急性冠状动脉综合征(Acute coronary syndrome, ACS)是冠心病中致死率最高的临床类型。众多研究表明，决定ACS发生的关键因素是冠状动脉内斑块的稳定性,所以不稳定斑块（unstable plaque）是ACS的关键病理基础，不稳定斑块发生糜烂或破裂，诱发急性血栓形成，最终导致恶性心血管事件发生。深入研究不稳定斑块的形成以及破裂对临床防治ACS，减少死亡率至关重要。但斑块―不稳定性‖机制尚不清楚。近年研究表明，炎症反应可以改变动物粥样硬化斑块的结构，参与动脉粥样硬化斑块的破裂，针对介导炎症反应的重要信号通路进行有效干预是阻止不稳定斑块形成的重要环节。而Toll样受体4（TLR4）信号介导的炎症反应是与粥样硬化斑块稳定性密切相关的重要分子机制，如何调控TLR4介导的炎症反应是稳定斑块、减少ACS发生的关键。胰岛素一直被认为是调节糖代谢的重要激素，但近年来，越来越多的证据表明：胰岛素具有多重作用，除了调节血糖代谢外，还可以通过PI3K-AKT通路抑制炎症反应。联系以往研究，在机体TLR-NF-κB信号通路被激活，炎症反应不断发展的过程中，PI3K-AKT通路活性受到抑制，但是加强PI3K-AKT通路活性受是否可以影响TLR-NF-κB信号通路则尚未见报道。基于以上我们设计并完成了相关实验。研究目的1.建立ApoE基因缺陷小鼠（ApoE-/-mice）不稳定斑块模型，观察胰岛素对斑块形成的影响；2.建立泡沫细胞模型模拟动脉粥样硬化斑块形成，观察胰岛素对泡沫细胞形成的影响；3.探讨胰岛素对泡沫细胞形成影响的机制，特别是对TLR4介导的炎症反应的影响。实验方法1．40只6-8W ApoE‐/‐小鼠高脂喂养1W后，随机分为对照组和手术组。手术组小鼠行右侧颈总动脉套管术，术后继续高脂喂养8W。8W末随机取手术组小鼠，过量麻醉处死，HE观察小鼠颈动脉斑块形成情况。2．确认斑块形成后，将手术组小鼠随机分为两组：手术组和胰岛素组。胰岛素组给予胰岛素皮下注射2W，手术组则用生理盐水代替。2W后，过量麻醉剂处死小鼠，ELISA法测小鼠血清炎症因子TNF-α和IL-6的分泌， HE染色观察颈动脉斑块形态，油红O染色观察斑块内脂质聚集，巨噬细胞免疫组化观察斑块内巨噬细胞聚集。3．体外培养巨噬细胞RAW264.7，建立巨噬细胞泡沫细胞模型。随机分为5组：（1）对照组；（2）ox-LDL组；（3）ox-LDL+insulin组；（4）ox-LDL+insulin+wortmannin组；（5）ox-LDL+wortmannin组。油红O染色观察细胞内脂质聚集情况，ELISA法测培养液中炎症因子TNF-α和IL-6分泌，TUNEL法测巨噬细胞凋亡，real-timePCR法测TLR4、MMP9的mRNA转录情况，western blot法测TLR4、Myd88、NF-κB蛋白表达。实验结果1． ApoE‐/‐小鼠通过PCCP手术高脂喂养8W后，HE染色结果显示：手术组小鼠颈动脉内出现动脉粥样硬化斑块，其内部脂质池较大，而对照组小鼠颈动脉管壁光滑，无斑块形成，建模成功。2．胰岛素注射2W后，三组小鼠的TC、TG、以及LDL无显著差异。ELISA测外周血炎性因子TNF-α与IL-6显示：手术组与对照组炎性因子无差异；与手术组比较，胰岛素组血清炎性因子含量减少，有显著差异（P <0.05）。HE染色结果显示：与手术组相比，胰岛素组颈动脉腔内的斑块脂质池减少，斑块结构较为稳定；油红O染色结果显示：与手术组相比，胰岛素组斑块内脂质含量显著降低（P <0.05）；巨噬细胞免疫组化染色显示：胰岛素组较手术组巨噬细胞含量显著降低（P <0.05）。3．油红O染色与TUNEL结果显示：50mg/L的ox-LDL可以成功诱导巨噬细胞泡沫化，巨噬细胞内有大量红色脂滴颗粒存在，且促进巨噬细胞凋亡(P <0.01vs对照组)，而胰岛素干预后可以显著抑制巨噬细胞对ox-LDL的吞噬，细胞内红色脂滴颗粒显著减少，巨噬细胞凋亡减少(P <0.01vs ox-LDL)，而应用PI3K抑制剂抑制胰岛素PI3K信号通路后胰岛素的作用被显著减弱(P <0.01vs ox-LDL+insulin)。4． ox-LDL干预细胞后，细胞培养液中炎性因子TNF-α与IL-6分泌显著增加（P <0.01）； TLR4、Myd88、NF-κB的mRNA和蛋白表达水平上调(P <0.05vs对照组)，同时与对照组相比，MMP9的mRNA水平也显著增高（P <0.01)。胰岛素干预后，培养液中的炎性因子TNF-α与IL-6分泌显著下降（P <0.01vsox-LDL），TLR4、Myd88、NF-κB的mRNA和蛋白表达水平显著下调(P <0.05vs ox-LDL)，同时MMP9的mRNA水平也显著降低（P <0.01vs ox-LDL)。PI3K抑制剂抑制胰岛素PI3K信号通路后，胰岛素的抑制作用被显著减弱， TNF-α与IL-6分泌显著增加（P <0.01vs ox-LDL+insulin），TLR4、Myd88、NF-κB、MMP9的mRNA和蛋白水平也显著增加（P <0.05vs ox-LDL+insulin）。结论1．成功建立了ApoE-/-小鼠不稳定性较高的动脉粥样斑块模型，胰岛素干预可以有效降低小鼠血清中炎性因子TNF-α和IL-6的含量，降低小鼠颈动脉粥样硬化斑块的不稳定性；2．胰岛素可以抑制巨噬细胞的泡沫化，抑制由于ox-LDL诱导引起的炎性因子TNF-α、IL-6的分泌与巨噬细胞凋亡；3．胰岛素通过PI3K-AKT信号通路抑制TLR4-MyD88-NF-κB信号通路，从而抑制炎性因子的表达，发挥其抗炎保护心血管作用。