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研究目的:
探讨CpG-ODN对人肺腺癌A549细胞的增殖及其抑癌基因Runx相关转录因子3(Runx3)表达的影响,探讨TLR9与肺腺癌发生发展的关系,为基于TLR9的肿瘤治疗寻找理论依据。
研究方法:
(1)不同浓度CpG-ODN作用于人肺腺癌A549细胞系,用MTT法检测细胞的增殖能力。
(2)CpG-ODN诱导A549细胞后,用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)和Western blot方法,分别从mRNA和蛋白水平检测Runx3的表达情况。
(3)针对Runx3基因的特定靶位,采用化学合成法合成Runx3 siRNA,并瞬时转染A549细胞,用荧光显微镜对Runx3 siRNA转染的A549细胞进行转染效率测定;用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)和Western blot方法,分别检测Runx3siRNA瞬时转染入A549细胞后,Runx3在mRNA和蛋白水平的表达情况。
(4)Runx3 siRNA瞬时转染A549细胞后,用MTT法观察CpG-ODN对转染前后的细胞生长作用的影响。
研究结果:
(1)CpG-ODN能明显抑制人肺腺癌A549细胞的增殖。
(2)不同浓度CpG-ODN刺激A549细胞后,细胞中Runx3基因在mRNA和蛋白表达水平均增加。
(3)Runx3 siRNA瞬时转染A549细胞后,根据荧光显微镜下观察到的荧光细胞比例,判断siRNA转染效率,约为40%;Real-time PCR结果显示,与未转染组相比,Runx3 siRNA转染A549细胞24h后,Runx3基因表达受到明显抑制;western blot检测显示,与未转染组相比,Runx3 siRNA转染A549细胞24h后,Runx3蛋白含量明显下降。
(4)Runx3 siRNA的瞬时转入对CpG-ODN刺激的A549细胞增殖抑制作用明显减弱。
结论:
人肺腺癌A549细胞表达TLR9基因,TLR9激动剂CpG-ODN作用于人肺腺癌A549细胞后,能明显抑制A549细胞的增殖。不同浓度CpG-ODN刺激A549细胞后,细胞中抑癌基因Runx3在mRNA和蛋白表达水平均增加。本试验针对Runx3基因的特定靶位,用化学合成法合成Runx3 siRNA,Runx3 siRNA的瞬时转入对CpG-ODN刺激的A549细胞增殖抑制作用明显减弱,TLR9的配体CpG-ODN可抑制A549细胞的增殖,同时正向调控Runx3的表达。由此推测,CpG-ODN可能通过上调Runx3抑制A549细胞的增殖。