【研究背景】人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在人群中感染广泛。虽对免疫正常人群无明显损害,但对免疫功能低下者危害明显,如造血干细胞和器官移植接受者可导致严重疾病;宫内感染可造成小头畸形和感音神经性耳聋等缺陷;围生期感染易致间质性肺炎和肝炎等,表明机体免疫状态与HCMV的致病性和疾病严重程度密切相关。巨细胞病毒具有严格种属特异性,无法建立HCMV的动物感染模型,通常利用小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)感染小鼠模型进行整体研究。然而,MCMV对不同鼠系的致病力亦有明显差异,BALB/c小鼠对MCMV易感并常呈慢性持续性感染,而C57BL/6小鼠对MCMV有天然抗性且只引起急性感染过程。一直认为,C57BL/6小鼠对MCMV的抵抗力主要依赖于自然杀伤(natural killer,NK)细胞的特异性Ly49H-m157途径。基于本课题组前期研究已经发现BALB/c和C57BL/6小鼠NK细胞和特异性免疫细胞的CD11c表达模式有明显差异,推测很可能还存在其他抗MCMV免疫应答的差异与不同鼠系的MCMV感染结局不同相关。NK细胞作为固有免疫的重要组分,可通过细胞毒作用和分泌IFNγ在感染早期识别病原体并启动抗病毒免疫进程。已发现NK细胞对CD8+T细胞免疫反应有调节作用,IFNγ、IL10和IL18也可影响抗MCMV免疫应答。本文拟对比研究具有不同感染结局的两鼠系在感染MCMV后NK细胞毒活性和功能性NK细胞活化以及相关炎性因子Thpok、IFNβ、IFNγ、IL18和IL10表达变化,分析其时序性变化差异与MCMV不同感染结局的相关性。天然免疫细胞内识别ds DNA的AIM2炎性体是“桥接”抗MCMV天然免疫和获得性免疫的关键环节。一旦被激活,AIM2可通过衔接子ASC募集caspase-1前体形成炎性体,并裂解caspase-1前体为活性片段,最终将无活性的IL1β和IL18前体转变为成熟的IL1β和IL18。有研究发现,p202可与AIM2竞争结合ASC,阻碍caspase-1的激活,推测AIM2炎性体在BALB/c和C57BL/6小鼠MCMV感染进程中可能具有不同的活化模式,这种不同的活化状态可能对宿主抗病毒免疫和感染结局产生影响,最终导致BALB/c小鼠的MCMV慢性化感染。【研究目的】1.建立BALB/c和C57BL/6小鼠的MCMV播散性感染模型,测定各感染阶段脾组织中NK细胞抗病毒功能的改变,分析NK细胞在两鼠系中不同的抗病毒效应;并对脾脏各免疫相关因子的转录水平以及病理改变作进一步评估。通过比较两鼠系间的差异找出NK细胞不同的抗病毒效应对MCMV感染结局的影响。2.检测两鼠系MCMV播散性感染进程中AIM2炎性体的活化状态,对比观察两者AIM2炎性体通路各组分蛋白的时序性表达和AIM2抑制物p202的转录水平差异,并分析其与感染脏器病变严重程度和病毒复制状态的相关性,以明确AIM2炎性体是否参与MCMV感染慢性化机制。【方法】第一部分BALB/c和C57BL/6小鼠感染MCMV后NK细胞、IFNγ和IL10的反应不同1.BALB/c和C57BL/6小鼠MCMV播散性感染模型:5周龄的BALB/c和C57BL/6雌性小鼠,腹腔注射接种MCMV Smith株5×104 PFU/只建模,在感染MCMV后1、3、7、14和28天分别随机处死4只小鼠,无菌留取小鼠的脾、肝和唾液腺。每种鼠系另有4只小鼠腹腔注射等体积的DMEM培养基,在注射后7天,无菌留取上述组织样本,作为模拟对照组;2.脾脏NK细胞类型与功能:制备脾细胞悬液,用磁珠分选法获得NK细胞,通过检测LDH释放量评估NK细胞毒活性;用流式细胞术检测脾细胞中CD69+NK细胞、IFNγ+NK细胞和总NK细胞的含量;分析C57BL/6小鼠感染后Ly49H+NK细胞在CD69+NK和IFNγ+NK细胞中所占比例;3.炎性因子表达:提取脾组织总RNA,逆转录获取c DNA。利用q RT-PCR法检测各组小鼠脾脏内相关炎性因子包括Thpok、IFNβ、IL10、IL18和IFNγ的m RNA转录水平;4.脏器病理改变:制备脾脏和肝脏组织切片,HE染色,对脾脏病理变化进行评估;并采用HAI评分来评价肝脏病变严重程度;5.病毒载量评估:q RT-PCR法检测各组小鼠脾脏、肝脏和唾液腺中MCMV g B的m RNA水平,并用标准蚀斑法测定唾液腺中病毒滴度,对比观察BALB/c和C57BL/6小鼠在不同感染阶段的病毒复制情况。第二部分BALB/c小鼠AIM2炎性体活化时相较短与其MCMV感染慢性化有关1.BALB/c和C57BL/6小鼠MCMV播散性感染模型:建模方法和采样时间点同第一部分。除脾脏、肝脏和唾液腺组织外,还收集外周血,离心留取血清;2.AIM2炎性体通路组分蛋白的表达:提取小鼠的腹腔原代巨噬细胞并留取脾组织;Western blot法检测各组小鼠腹腔原代巨噬细胞和脾组织中AIM2、caspase-1前体、caspase-1活化片段(caspase-1 p20)、IL1β前体和成熟IL1β(IL1βp17)的蛋白表达水平;3.ELISA法检测各组小鼠血清中IL18水平;4.AIM2抑制物p202的转录水平:留取各组小鼠肝组织,提取组织RNA,q RT-PCR法检测p202 m RNA表达水平;5.脏器病理改变和病毒载量评估:同第一部分。【结果】第一部分BALB/c和C57BL/6小鼠感染MCMV后NK细胞、IFNγ和IL10的反应不同1.NK细胞总数:在感染各阶段,C57BL/6小鼠脾组织中的总NK细胞数均多于BALB/c小鼠(P<0.01);C57BL/6小鼠在感染后7~28天脾内NK细胞比率是下降的,但细胞计数还明显高于感染后1~3天。2.NK细胞毒作用:与模拟对照组相比,BALB/c小鼠在感染MCMV后1、3和7天NK细胞毒作用增强,而C57BL/6小鼠在感染全程中NK细胞毒作用均强于模拟对照组(P<0.05)。两鼠系相比,除感染3天时两者无明显差异外,C57BL/6小鼠的NK细胞毒作用均强于BALB/c小鼠(P<0.05)。3.CD69+NK细胞:与模拟对照组相比,BALB/c小鼠脾组织中CD69+NK细胞在感染后1天时增多,而C57BL/6小鼠的CD69+NK细胞在感染后1、3和28天时都增多(P<0.05)。两鼠系相比,C57BL/6小鼠在感染后3、7、14和28天时CD69+NK细胞均多于BALB/c小鼠(P<0.05)。4.IFNγ+NK细胞:BALB/c小鼠的IFNγ+NK细胞在整个感染进程中未出现增多,在感染后期甚至明显低于模拟对照组(P<0.05)。C57BL/6小鼠的IFNγ+NK细胞虽然只在感染后1天和3天时增加,但在感染各阶段仍高于BALB/c小鼠(P<0.05)。5.Ly49H+NK细胞在感染后明显增加,但在CD69+NK细胞中的比率最高达35%(感染后14天),在IFNγ+NK细胞中的比率更低,峰值为11.7%(感染后3天)。6.脾组织Thpok和IFNβ的m RNA表达:BALB/c小鼠脾组织中Thpok m RNA水平在感染后1、3、7和28天时高于模拟对照组,而C57BL/6小鼠则呈持续性低表达(P<0.05)。BALB/c小鼠的IFNβ表达仅在感染1天时增多,C57BL/6小鼠在感染后3、7和28天时表达明显增多(P<0.05)。两鼠系相比,BALB/c小鼠的Thpok表达高于C57BL/6小鼠;但就IFNβ而言,BALB/c小鼠仅在感染后头3天表达较高,感染7天后表达水平低于C57BL/6小鼠(P<0.05)。7.炎性因子IFNγ、IL18和IL10的m RNA表达:BALB/c小鼠脾组织中IFNγm RNA水平在感染后头7天内都高于模拟对照组,IL18转录水平仅在感染后1天时明显增多(P<0.05)。C57BL/6小鼠感染后3天时IFNγm RNA表达增加,在感染后14天和28天表达下降,低于模拟对照组;而IL18转录水平在感染全程均未增加,在感染后期低于模拟对照组(P<0.05)。两鼠系比较,BALB/c小鼠在感染过程中IFNγ和IL18转录水平均高于C57BL/6小鼠(P<0.05)。BALB/c和C57BL/6小鼠的IL10表达模式相似,均仅在感染3天时转录水平增高;两鼠系相比,BALB/c小鼠的IL10表达水平在感染后1天和3天高于C57BL/6小鼠,在感染后的7~28天又低于C57BL/6小鼠(P<0.05)。8.脏器病理改变:BALB/c小鼠感染MCMV后脾脏的病理改变重于C57BL/6小鼠;肝脏HAI评分亦明显高于C57BL/6小鼠(P<0.05)。9.病毒载量评价:BALB/c小鼠脾脏、肝脏和唾液腺的MCMV复制水平和唾液腺内感染性病毒滴度在各时间点都明显高于C57BL/6小鼠(P<0.05)。第二部分BALB/c小鼠AIM2炎性体活化时相较短与其MCMV感染慢性化有关1.腹腔巨噬细胞的AIM2炎性体活化:BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞中AIM2蛋白含量在感染后1天和7天时增加。Caspase-1前体和IL1β前体在感染进程中呈均一性稳定表达,但其活化片段caspase-1 p20和IL1βp17均在感染后7天时表达增加。就C57BL/6小鼠而言,腹腔巨噬细胞的AIM2蛋白在感染后3、7和14天时表达增加;caspase-1前体和IL1β前体的表达与BALB/c小鼠相似,但caspase-1 p20和IL1βp17在感染后7天时蛋白表达增加,并持续至感染后28天。2.脾脏的AIM2炎性体活化:感染MCMV后,BALB/c小鼠的AIM2蛋白在感染后1天和3天时表达增强,而C57BL/6小鼠在感染后3~28天内AIM2蛋白表达均有增多;两鼠系caspase-1前体和IL1β前体的表达在感染进程中稍有波动;BALB/c小鼠的caspase-1 p20在感染后1天和3天时含量增加,IL1βp17在感染后7天时表达增加,而C57BL/6小鼠在感染后7~28天内caspase-1 p20和IL1βp17表达水平均增高。3.血清IL18水平:与模拟对照相比,BALB/c小鼠血清中IL18含量仅在感染后3天时增加,而C57BL/6小鼠的血清IL18含量在感染后呈双峰型(感染后1天和14天)持续高表达(P<0.05)。4.肝组织p202表达:BALB/c小鼠肝脏中p202 m RNA表达在感染后1天就开始明显增加,至感染后7天达峰值,随后快速降低;而C57BL/6小鼠肝脏中p202 m RNA水平极低,无法被检测到。5.脏器病理和病毒载量改变见第一部分。【结论】1.C57BL/6小鼠感染MCMV后更强效的NK细胞抗病毒功能以及适宜表达的IL10有利于病毒的快速清除;2.C57BL/6小鼠Ly49H+NK细胞占CD69+NK和IFNγ+NK细胞中比率最高为35%和11.7%,提示还存在独立于Ly49H-m157通路之外的NK细胞亚群或途径与其抗病毒机制相关;3.BALB/c小鼠的NK细胞毒作用远不及C57BL/6小鼠;尽管有相对高表达的IFNγ,仍不能弥补其NK细胞功能的不足;4.BALB/c小鼠AIM2炎性体仅在MCMV感染早期活化,而C57BL/6小鼠可持续至急性期末;前者更为短暂的AIM2炎性体活化可能是其MCMV感染慢性化的另一重要机制;5.BALB/c小鼠在感染早期快速上调AIM2抑制物p202表达,而C57BL/6小鼠不表达p202,提示p202参与AIM2炎性体活化的调控。