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研究背景:光感受器细胞是视网膜中一类负责处理和传递视觉信息的神经元细胞。其功能是将光刺激转化为生物电信号,从而形成视觉。当细胞能量供给出现障碍,或者接受强烈的光刺激时,光感受器细胞会发生不可逆性的损伤,从而造成患者视觉功能的损害,甚至致盲,这严重影响患者的身心健康和生活质量。因此,研究光感受器细胞损伤机理及其防治方法具有重要的理论意义和实际意义。亚低温治疗方法是指通过物理或者化学的方法将患者的体温保持在特定温度,从而改善疾病治疗效果的方法。在神经系统疾病治疗中,亚低温治疗方法已经开展了广泛的研究,如中风、颅脑损伤、颅内压升高、蛛网膜下腔出血、脊髓损伤、肝性脑病和新生儿围产期脑病等。有研究也表明亚低温能减轻脑神经元的损伤、减轻内皮细胞和血脑屏障的功能障碍,保护机制可能与抑制细胞凋亡相关。因此,本研究拟分别探讨亚低温在能量衰竭(葡萄糖剥夺)和光损伤细胞模型中的保护作用,解释亚低温治疗方法的可能作用机制,并在动物模型中初步观察亚低温对视网膜光损伤的保护作用。目的:1.通过光感受器细胞(661w细胞)能量衰竭(葡萄糖剥夺)模型、光损伤模型,明确亚低温对光感受器细胞损伤的保护作用。2.通过过表达/敲低低温相关蛋白——冷诱导应激蛋白Cirbp(Cold-inducible RNA-binding protein),探讨亚低温对光感受器细胞能量衰竭(葡萄糖剥夺)模型、光损伤模型保护作用的分子机制。3.通过动物模型,初步观察亚低温对视网膜光损伤的保护作用及机制。方法:1.探讨亚低温对能量衰竭的661w细胞的保护作用利用无糖培养法制备能量衰竭细胞损伤模型,并将细胞分为常温组(37℃)与亚低温组(32℃)。使用MTT法检测不同剥夺时间每个实验组的细胞活性改变,同时利用Hoechest/PI法、流式细胞术、活性氧ROS(Reactive oxygen species)染色、线粒体膜电位检测以及Western Blot等方法检测每个实验组的细胞凋亡情况。2.探讨亚低温对光损伤的661w细胞的保护租用制备光损伤细胞模型,并将细胞分为常温组(37℃)与亚低温组(32℃)。利用Hoechest/PI法、活性氧ROS染色、线粒体膜电位检测以及Western Blot等方法检测不同实验组的细胞凋亡情况。3.探究亚低温对661w细胞的保护作用机制(1)使用慢病毒感染661w细胞,制备过表达/敲低Cirbp细胞株。(2)过表达/敲低Cirbp细胞株分别制备成能量衰竭和光损伤细胞模型。通过Hoechest/PI法、活性氧ROS染色以及Western Blot等方法检测Cirbp对亚低温保护作用的影响及亚低温保护作用的机制。4.探讨亚低温对视网膜的保护作用机制在动物模型中,通过观察视网膜外核层厚度以及视网膜电生理图ERG(electroretinogram)改变,研究亚低温对光损伤视网膜的保护作用。并通过Western Blot检测相关蛋白的表达,探究亚低温对视网膜保护作用的可能机制。结果:1.661w细胞进行无糖培养后,细胞活性24h内显著下降。亚低温实验组与常温实验组相比,无糖培养8h和16h能明显改善细胞活性,但24h时两组细胞活性并无明显差别。同时,在无糖培养16h时,亚低温实验组凋亡细胞明显减少、活性氧生成减少、线粒体膜电位下降的程度降低。与常温实验组相比,亚低温实验组的Caspase依赖凋亡通路的凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、BAX(Bcl-2-associated X)下降,抗凋亡相关蛋白Bcl-2(B-cell lymphoma-2)等上升,而冷诱导应激蛋白Cirbp表达则明显上升。2.光损伤下的661w,亚低温实验组与常温实验组相比,凋亡细胞明显减少、活性氧生成减少、线粒体膜电位改变降低。与常温实验组相比,亚低温实验组的PARP-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1)依赖凋亡通路的凋亡相关蛋白PARP-1下降,而冷诱导应激蛋白Cirbp表达则明显上升。3.过表达Cirbp的661w细胞与对照的661w细胞相比,常温下无糖培养16h时,凋亡细胞明显减少、活性氧生成减少、Caspase依赖凋亡通路的凋亡相关蛋白Caspase-3、BAX下降,抗凋亡相关蛋白Bcl-2等上升。在光损伤细胞中,凋亡细胞与活性氧生成较对照组也减少,而PARP-1依赖的凋亡相关蛋白PARP-1则下降。4.敲低Cirbp的661w细胞与对照的661w细胞相比,亚低温下无糖培养16h时,凋亡细胞明显增加、活性氧生成增加、Caspase依赖凋亡通路的凋亡相关蛋白Caspase-3、BAX表达上升,抗凋亡相关蛋白Bcl-2等表达下降。在光损伤中,凋亡细胞与活性氧生成较对照组也增加,而PARP-1依赖凋亡通路的凋亡相关蛋白PARP-1则表达上升。5.在体内实验中,亚低温光损伤组的视网膜厚度明显厚于光损伤组,且细胞形态清晰、结构正常。视网膜电生理检测的视网膜功能也优于对照组。PARP-1表达较对照组也被明显抑制。结论:本研究以661w为研究对象,选择不同凋亡机制的能量衰竭模型与光损伤模型作为体外体外实验模型,探索亚低温在其中所发挥的保护作用及可能机制。结果表明,亚低温能够上调冷诱导应激蛋白Cirbp的表达、抑制活性氧的生成;同时,抑制能量衰竭模型诱导的Caspase依赖的凋亡以及光损伤模型诱导的PARP-1的凋亡。Cirbp是亚低温保护作用的重要分子靶点。此外,亚低温可以减轻光损伤下视网膜的病理改变,改善视网膜受损的功能。