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糖尿病是一种在全世界范围内普遍存在的慢性代谢性疾病,对人们的健康以及医疗资源产生了严峻的影响。目前,胰岛移植有望治疗糖尿病,但由于胰岛供体短缺和免疫排斥问题而受限。因此,寻找其它来源的胰岛素分泌细胞（Insulin producing cells,IPCs）进行移植成为治疗糖尿病的有效途径。在近几年的研究中,虽然体外诱导干细胞分化为IPCs已初见成效,但IPCs的分化程度和胰岛素分泌量都很低。通过查找文献发现在胰岛的发育、成熟过程中,Pdx1、Ngn3、Pax4和Nkx2.2都起着一定的作用,也有研究证明将这些基因单独转入干细胞对于诱导其向IPCs分化具有促进作用,只是分化效率不够稳定,IPCs的胰岛素分泌量低而且不随葡萄糖浓度变化而变化。本实验室之前通过测序分析筛选出可能在诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化过程中起作用的新基因Dll1,我们从研究Dll1基因在体外诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化中的作用入手,进一步研究Dll1与Pdx1、Ngn3、Pax4或Nkx2.2不同组合重编程犬脂肪MSCs为IPCs的效果。主要研究结果如下:1.为研究Dll1基因在体外诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化中的作用,我们在犬脂肪MSCs中过表达Dll1,以及通过si RNA将Dll1基因沉默,分别诱导Dll1基因过表达的MSCs株和Dll1基因沉默的MSCs株向IPCs分化。（1）RT-q PCR检测,过表达Dll1组Maf A、Nkx6.1和Ins基因表达量极显著高于（P<0.001）对照组（48.975±3.578 vs 33.975±3.453;55.156±6.267 vs 25.106±1.267;39.258±3.752 vs 21.533±2.401）;Dll1沉默组Pdx1、Maf A、Pcsk2和Ins基因表达量极显著低于（P<0.001）对照组（4.388±0.898 vs15.997±1.660;9.365±1.356 vs 33.975±3.453;16.358±1.258 vs 27.538±2.935;12.397±0.369vs 21.533±2.401）。（2）双硫腙染色,过表达组细胞团呈显猩红色。（3）免疫荧光检测,过表达组细胞团分泌胰岛素。（4）高糖刺激下,过表达Dll1组胰岛素分泌量（160.25±10.35μIU/10~5个细胞）极显著高于（P<0.001）对照组的胰岛素分泌量（125.23±4.35μIU/10~5个细胞）,Dll1沉默组胰岛素分泌量（101.367±5.367μIU/10~5个细胞）极显著低于（P<0.001）对照组的胰岛素分泌量;KCl刺激下,各个组合的胰岛素分泌量与高糖刺激下相似。过表达Dll1组的胰岛素刺激释放指数SI（2.70±0.05）显著高于（P<0.01）对照组SI（2.36±0.11）,Dll1沉默后胰岛素刺激释放指数SI（2.16±0.08）极显著低于（P<0.001）对照组SI。2.构建三个组合腺病毒多基因共表达穿梭载体p Ad Track-CMV-Dll1-Pdx1-Ngn3、p Ad Track-CMV-Dll1-Pdx1-Ngn3-Pax4和p Ad Track-CMV-Dll1-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2,验证正确后,将其分别与p Ad Easy-1重组,获得重组腺病毒多基因共表达载体p Ad Easy-Dll1-Pdx1-Ngn3（组合一）、p Ad Easy-Dll1-Pdx1-Ngn3-Pax4（组合二）和p Ad Easy-Dll1-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2（组合三）,并进行了验证,感染293A细胞。（1）RT-q PCR显示,组合一（Pdx1 2000±100、Ngn3 1956±56和Dll1 1900±100）,组合二（Pdx1 1966±66、Ngn31865±65、Dll1 2000±100和Pax4 1999±99）和组合三（Pdx1 1856±56、Ngn3 1799±99、Dll1 1823±100和Nkx2.2 1911±100）的m RNA均有平衡表达。（2）Western-blot检测,三个组合均可表达目的基因的蛋白。3.将三个组合的重组腺病毒毒液分别感染犬脂肪MSCs,重编程犬脂肪MSCs成为IPCs。（1）感染48h后三个组合均表达GFP,培养25 d后组合二的细胞成团数最多,每10~6个犬脂肪MSCs中约有121±6个细胞团,细胞团的直径约为100±9μm,每个细胞团中约有115±14个细胞（n=3）。（2）双硫腙染色,三个组合中的细胞团均呈现猩红色,但组合二颜色最深。（3）RT-q PCR检测,组合二Pdx1、Maf A基因表达水平显著高于组合一（29.785±2.155 vs 21.095±2.125;24.578±2.135 vs 15.888±1.105）,组合二Nkx6.1、Pcsk2基因表达水平高于组合一（32.578±4.98 vs 19.888±5.036;18.268±3.175 vs 9.578±3.145）。组合二Pdx1、Maf A、Nkx6.1基因表达水平高于组合三（29.785±2.155 vs25.225±2.195;24.578±2.135 vs 20.018±2.175;32.578±4.98 vs 24.018±5.106）。（4）高糖刺激下,组合一胰岛素分泌量（58.51±3.64μIU/10~5个细胞）,组合二胰岛素分泌量（135.97±4.26μIU/10~5个细胞）,组合三胰岛素分泌量（113±3.26μIU/10~5个细胞）,组合二的的分泌量均显著高于（P<0.01）组合一和组合二,但组合二分泌在高糖刺激下胰岛素分泌量极显著低于（P<0.001）胰岛细胞的胰岛素分泌量。组合二的胰岛素刺激释放指数SI（2.33±0.09）也均高于其他两组,但显著低于（P<0.01）胰岛细胞SI（2.71±0.08）。结果表明,Dll1基因表达对体外诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化具有促进作用;三个组合均能使MSCs重编程为IPCs,四基因组合的重编程效果都远远优于三基因组合,在四基因组合中,组合二的重编程效果优于组合三。