论文部分内容阅读
前言乳腺癌是严重影响女性身心健康的常见恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升的趋势。随着对乳腺癌生物学行为和临床研究的不断深入,其整体治疗水平已经有了长足的进步。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators activated receptors,PPARs)是核激素受体超家族中的一员,属配体依赖的核转录因子,在脂肪形成、脂质代谢、维持血糖稳定、调节炎症过程中均有一定作用,但是近年来PPARs在肿瘤发生发展中的作用引起了人们的关注,其中以PPARs亚型PPARγ与肿瘤的关系最为密切,成为研究的热点。研究发现,PPARγ作为一种重要的细胞调节因子,不仅表达于正常脂肪组织和免疫系统,而且在乳腺癌、结肠癌、肺癌等多种肿瘤中高表达,被其特异性配体如前列腺素D2(PGD2)的代谢产物15-d-PGJ2、罗格列酮(ROZ)等激活后可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成和降低肿瘤侵袭能力,具有潜在的抗肿瘤作用。但目前PPARγ及其配体在肿瘤发生发展过程中的作用机制尚不甚明了,一些方面还存在很大争议。抗肿瘤药物多西他赛(Docetaxel,DOC,多西紫杉醇)是从浆果紫杉针叶中提取的前体物再经半合成改造而成,其基本结构类似紫杉醇,但水溶性较高,作为化疗药物在临床上已广泛应用于乳腺癌、肺癌、胃癌和食管癌等的治疗,它是一种可通过抑制肿瘤细胞生长和侵袭双重途径起效的、具有很好的靶向性的抗肿瘤药物。多西他赛通过稳定微管蛋白构象,抑制微管解聚,使细胞不能进行正常的有丝分裂从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用。细胞粘附因子CD44是黏附分子家族中的重要成员,广泛存在于白细胞、上皮细胞及内皮细胞上,主要介导细胞与细胞,细胞与基质之间的黏附。含有变异性拼接外显子的CD44转录子称为CD44v,其表达主要出现在病理过程中,研究发现,CD44v6可通过改变肿瘤细胞表面粘附分子的构成和功能增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。临床资料显示,常规的高剂量化疗药物治疗不仅会对患者产生不同程度的毒副作用,而且还有可能导致不可逆性损害,甚至危及患者生命。研究表明,与低毒药物联合应用既能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,又能通过降低化疗药物的用药剂量而减轻化疗药物毒性,而且有助于进一步阐明肿瘤浸润、侵袭转移的作用机制,为肿瘤的预防和药物治疗提供新的思路和途径。目的1.多西他赛及PPARγ特异性配体罗格列酮以及两药联合应用对人乳腺癌细胞MCF-7增殖能力的影响;2.多西他赛、PPARγ特异性配体罗格列酮以及两药联合应用对人乳腺癌细胞MCF-7细胞周期变化的影响;3.多西他赛、PPARγ特异性配体罗格列酮以及两药联合应用对人乳腺癌细胞株MCF-7中CD44v6表达水平的影响;4.探讨多西他赛与罗格列酮两种药物对人乳腺癌细胞MCF-7作用的影响机制,为乳腺癌的多途径、多靶点治疗提供理论依据。方法一、细胞培养-70℃冰箱中取出装有人乳腺癌细胞株MCF-7的冻存管,放入370C水浴箱中快速摇晃直至冻存液完全融化。将解冻细胞悬液移入预热含10%胎牛血清RPMI1640培养液的培养瓶,370C,5%CO2培养箱培养。次日更换培养液继续培养。倒置显微镜下观察细胞呈单层贴壁生长,瓶底面积覆盖达75%-80%时进行传代。二、MTT法检测药物对MCF-7细胞增殖能力的影响取对数生长期细胞制成细胞悬液,按每孔5×103个细胞接种到96孔板中孵育。药物处理24h、48h、72h后每孔加入5mg/ml的MTT 50ul,37℃继续孵育4小时离心后弃上清液,并每孔加入DMSO 100ul,振荡5min,自动酶联检测仪于540nm波长处测定各孔吸光度(A540)值,并计算增殖抑制率及两药联合应用效果q值。计算公式为:抑制率(%)=[(阴性对照组A540值-实验组A540值)/阴性对照组A540值]×100%,q=E(A+B)/[EA+(1一EA)×EB]。三、流式细胞术碘化丙啶(PI)单染法检测药物对MCF-7细胞周期的影响取对数生长期细胞于培养瓶中培养,细胞贴壁后加入处理药物。24小时后收集细胞,离心并弃上清后加入1ml PBS重悬细胞,将重复上述步骤3次后得到的单细胞悬液缓缓加入-20℃预冷的75%乙醇中,4℃过夜。次日取出细胞,离心并弃去固定液,PBS漂洗后再次离心后弃上清并移入流式管中,每流式管内加入10mg/L RNase A 30ul,100ug/ml碘化丙啶(PI)染色液400ul,37℃避光培养30min后流式细胞仪检测细胞周期。四、RT-PCR法检测药物对MCF-7细胞CD44V6表达水平的影响取对数生长期细胞于培养瓶中培养,细胞贴壁后加入不同处理药物,药物作用24h确定细胞数量后吸除培养基,用PBS洗涤细胞,吸除PBS后加入含有0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞,细胞脱离容器壁时加入含血清的培养基灭活胰蛋白酶,并将细胞溶液转移至RNase-free的离心管中,离心后收集细胞沉淀并吸除上清。根据TIANGEN公司总RNA提取试剂盒(离心柱型)说明书操作提取细胞总RNA。根据GENEBANK提供的CD44v6 mRNA序列,应用软件Primer Premier5.0设计引物,上游引物为5’-AGACAGAAATGGCACCAC-3’,下游引物为5’- AATGGGAGTCTTCTTTGG-3’。分别取各药物处理组细胞总RNA 8μl,参照TransScript Two-step RT-PCR SuperMix试剂盒说明书操作合成cDNA并进行PCR扩增反应,PCR扩增反应条件:94℃预变性5min,94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸30s,循环36次,72℃终末延伸10min。配制2% Agrose凝胶,检测PCR产物。实验结果1.多西他赛、罗格列酮单独应用对乳腺癌细胞MCF-7的增殖均有抑制作用。罗格列酮联合多西他赛后使多西他赛对乳腺癌MCF-7细胞达最大抑制率的时间缩短,两药联合对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制有相加作用,并呈剂量-时间依赖性(P<0.05)。2.多西他赛可使乳腺癌MCF-7细胞阻滞在G2/M期,G2/M期细胞比率由对照组的5.83%±0.81%增加到6mg/L多西他赛组的20.61%±1.26%,8mg/L多西他赛组的25.23%±1.27%和10mg/L多西他赛组的27.75%±1.52%;罗格列酮可使乳腺癌MCF-7细胞阻滞在G0/G1期,G0/G1期细胞比率由对照组的75.29%±0.28%增加到80mg/L罗格列酮组的85.93%±0.70%。两药联合应用使乳腺癌MCF-7细胞阻滞在S期,80mg/L罗格列酮+6mg/L多西他赛组的S期细胞比率为13.86%±0.30%,80mg/L罗格列酮+8mg/L多西他赛组的S期细胞比率为19.99%±0.36%,80mg/L罗格列酮+10mg/L多西他赛组的S期细胞比率为20.65%±1.48%,随多西他赛剂量的增加而明显增加。3.多西他赛、罗格列酮均可使CD44v6 mRNA的条带亮度减弱,两药联合较单药作用条带亮度减弱明显,各不同药物处理组与对照组CD44v6表达比较差异有统计学意义(P<0.05),联合用药组与单药多西他赛、单药罗格列酮组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.多西他赛、罗格列酮均能抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,两药联合可能具有相加作用。多西他赛阻滞人乳腺癌细胞MCF-7在G2/M期,罗格列酮阻滞人乳腺癌细胞MCF-7在G0/G1期,并呈剂量依赖性。罗格列酮联合多西他赛阻滞人乳腺癌细胞MCF-7在S期略明显。2.多西他赛、罗格列酮均能下调CD44v6的表达,两药联合作用后对CD44v6表达下调作用较单药明显。