研究背景与目的:非酒精性脂肪性肝病(fatty liver disease,NAFLD)是指一组因机体代谢紊乱所致的以肝细胞脂肪变性为主要特征的临床病理综合征。NAFLD在早期是可逆的,发病进展过程中NAFLD的各危险因素变化是脂肪肝状态可能由NAFL发展到NASH甚至肝硬化或者表现为逐渐消退的重要影响因素。中医体质可以在很大程度上决定该个体对NAFLD内外致病因素的易感性及患病以后疾病可能表现的证型,更重要的是可以影响到个体对治疗效果的不同表现。因此,体质辨识及对NAFLD疾病影响的研究也就成了中医个性化论治研究的一个重要内容。研究中医体质因素和脂肪肝及危险因素各指标的关系,及其对脂肪肝发生与消退的影响,将为进一步防治NAFLD提供科学依据。骨桥蛋白(Ostepontin,OPN)是一种分泌性磷酸化糖蛋白,具有细胞因子的特点。近些年来一系列研究表明,在肝纤维化的发生发展过程中OPN具有促纤维化的作用,它不仅能够诱发肝星状细胞(HSC)的活化、增殖与迁移,也能引起肝脏内部I型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子β受体m RNA(TGF-βm RNA)以及蛋白质的产生,并且对肝巨噬细胞也有明显的趋化作用。本研究是利用高校体检队列人群,研究中医体质对脂肪肝发生和发展过程的作用特点,不同中医体质NAFLD在人群中的分布特点及其临床特征,及其对脂肪肝发生与消退的影响。为进一步防治NAFLD等心血管疾病危险因素提供科学依据。本研究还利用体检队列人群资料,评价基线OPN对NAFLD发生和消退的预测价值及中医体质对其的影响。最后,本研究利用大鼠脂肪性肝纤维化模型,考察OPN中和抗体特异性结合OPN蛋白并拮抗OPN生物学功能,观察有无干预及不同干预方案下肝脏病理改变和相关促纤因子的变化情况,以此初步评价OPN免疫中和方案治疗肝纤维化是否可行及效果如何。深入研究与OPN相关的肝纤维化的机制,有助于探索防治脂肪性肝纤维化的新策略或新的药物靶点。研究内容:1、基于队列人群的中医体质与非酒精脂肪肝的关系研究:2、血清Osteopontin对非酒精性脂肪肝发生和消退的预测评价;3、Osteopontin中和抗体在大鼠脂肪性肝纤维化消退中的作用研究;第一部分基于队列人群的中医体质与非酒精脂肪肝的关系研究目的:基于体检队列人群采用横断面和队列人群调查相结合的方法,研究中医体质因素与非酒精脂肪肝(NAFLD)及危险因素的分布及变化的关系,中医体质类型特点对非酒精脂肪肝发生与消退的影响。方法:采用横断面和队列人群调查相结合的方法,调查某高校连续五年参加体检的40岁以上人群,检测各项体检指标和中医体质问卷,对调查数据进行统计学描述和分析。结果:横断面调查:1、非酒精脂肪肝在人群的构成是以痰湿质、气虚质、湿热质为主;无论中度还是轻度脂肪肝人群都是痰湿质占比最多;湿热质以中度脂肪肝为主,气虚质以轻度脂肪肝为主。2、从易患非酒精脂肪肝的倾向性上,在湿热质、血瘀质、气郁质、平和质的男性脂肪肝检出率明显高于同体质类型女性,差异有统计学意义(P<0.05);在阴虚质、阳虚质的女性脂肪肝检出率高于同体质类型男性,差异有统计学意义(P<0.05)。3、非酒精脂肪肝的总检出率是伴随着年龄的增长而增加的。气虚质、平和质人群随年龄增加非酒精脂肪肝检出率逐步增加,湿热质人群随年龄增加检出率逐步减少。50-55岁年龄段是男女脂肪肝检出率变化的交叉点,交叉点前女性脂肪肝检出率低于男性,交叉点后女性脂肪肝检出率高于男性。队列人群调查:1、非酒精脂肪肝的年发病率明显高于年消退率,总的趋势是患病人数不断增加。2、新发脂肪肝人群以气虚质、湿热质、痰湿质为主,脂肪肝消退人群以痰湿质、气虚质、湿热质为主;新发脂肪肝的转化率从高到低依次为:气虚质、痰湿质、湿热质;脂肪肝消退的转化率从高到低依次为:气虚质、气郁质、阳虚质为主。第二部分血清Osteopontin对非酒精性脂肪肝发生和消退的预测评价目的:通过比较不同随访结局的研究对象基线血清骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)水平的差异,评价基线OPN对NAFLD发生和消退的预测价值。方法:研究对象来自某高校体检人群。从完成3年随访的人群中选择随访研究资料完整且符合标准的360名受试者纳入为研究对象,按随访终止时脂肪肝有无及变化结局分为以下四个组别:未发生组、新发组、维持组、消退组。全部研究对象均完成了肝脏超声诊断、体格检查、中医体质辨识、血清OPN浓度、各项糖脂代谢指标和肝酶的实验室检测。用logistic回归方法分析基线血清OPN在NAFLD的发生和消退中的预测作用。结果:新发生NAFLD人群基线血清OPN水平显著高于未发生NAFLD的人群48.47ng/ml(40.1,62.9)vs 38.18 ng/ml(34.2,51.2),(P<0.001)。维持组人群基线血清OPN水平显著高于消退组的人群54.16 ng/ml(33.2,71.3)vs 50.71 ng/ml(36.7,75.9),(P<0.05)。在维持组内可见易患脂肪肝体质人群的血清OPN水平明显高于非易患脂肪肝体质人群,59.11 ng/ml(55.2,73.5)vs 50.96 ng/ml(47.8,70.8),(P<0.05),未发生组、新发组、消退组未见有此明显差异。多元逐步回归显示基线血清OPN水平和BMI是预测NAFLD的独立预测危险因素,ROC曲线分析显示基线血清OPN+BMI预测模型对3年后NAFLD发生有很好的预测价值(曲线下面积为0.821,95%CI 0.773–0.839)。第三部分Osteopontin中和抗体在大鼠脂肪性肝纤维化消退中的作用研究目的:考察Osteopontin(OPN)中和抗体对脂肪性肝纤维化大鼠的干预效果,发掘其潜在的治疗价值;研究OPN中和抗体对脂肪性肝纤维化大鼠干预后,肝脏纤维化的表达变化及其与糖脂代谢的关系。方法:1)60只SD大鼠,其中对照组(N=8)、NAFLD造模组(N=52)采用经典CCl4诱导加高脂饮食喂养方法进行脂肪性肝纤维化造模,第6周造模成功后随机抽取8只大鼠作为模型组处死收集样本,再随机抽取24只分为自然消退组、OPN中和抗体干预组、秋水仙碱组。OPN中和抗体干预组从7周开始每隔一天通过尾静脉注射OPN抗体(滴度:1:15),持续4周(每次0.15m L);秋水仙碱组在第7周开始秋水仙碱干预治疗,对大鼠按照0.02mg/100g体重进行药水灌胃给药,持续4周;NAFAD自然消退组在第7周起停止高脂饮食,恢复为正常饮食,持续4周。分别于0周末、4周末、6周末、8周末、10周末随机抽取造模组各5、5、8、5、5只大鼠做生化、病理及western blot检测,评估造模及相关指标的变化情况。2)用real-time PCR和免疫印迹方法检测大鼠肝组织OPN和α-SMA的表达;用酶联免疫吸附试验检测肝纤维化相关指标;用病理组织学的HE和Masson染色方法检测大鼠肝纤维化的病理变化;采用大鼠血清检测肝功能指标、TC、TG、FBG、FINS、计算HOMA-IR、ISI。结果:1)OPN抗体干预组大鼠的OPN和α-SMA的m RNA水平及蛋白表达水平均显著低于自然消退组和模型组(P<0.01)。2)OPN抗体干预后,大鼠肝组织病理面积减少,纤维组织肥大,炎症细胞浸润减少。3)抗体干预组与秋水仙碱组的ColⅠ、PCⅢ、MMP-3、TGF-β1、α-SMA、TNF-α均明显低于自然消退组(P<0.05或P<0.01)。4)抗体干预组FPG、FINS、HAMO-IR、TG明显低于自然消退组(P<0.05或P<0.01);抗体干预组的FPG、FINS、HAMO-IR、TG、ISI、TG明显低于秋水仙碱组(P<0.05),而两组的TC指标未见明显统计学差异。结论:1、体检队列人群的中医体质与非酒精性脂肪肝分布特点如下:1)构成比:非酒精脂肪肝以痰湿质、气虚质、湿热质体质人群为主;易患性:痰湿质、气虚质、湿热质体质更易于患脂肪肝;在男性血瘀质、气郁质、湿热质体质更易于检出脂肪肝,在女性阴虚质、阳虚质体质更易于检出脂肪肝。2)非酒精脂肪肝发生和消退变化:新发脂肪肝人群以气虚质、湿热质、痰湿质为主,新发脂肪肝转化率从高到低依次为:气虚质、痰湿质、湿热质;脂肪肝消退人群以痰湿质、气虚质、湿热质为主;脂肪肝消退的转化率从高到低依次为:气虚质、气郁质、阳虚质。2、人体血清OPN水平是NAFLD发生的独立危险因素,可以成为预测NAFLD的新型血清标志物。易患脂肪肝的中医体质类型也是NAFLD发生的独立风险因素。3、在大鼠脂肪性肝纤维化建模过程中,OPN的高表达或激活α-SMA,上调下游HSC相关机制导致肝纤维化,而靶向抑制OPN能够显著改善大鼠非酒精脂肪肝所致肝纤维化,同时也能明显改善胰岛素抵抗和降低血清TG水平。