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针对重组埃博拉病毒病疫苗(Ad5-EBOV)临床试验中加强免疫后Ad5载体的中和抗体水和埃博拉病毒包膜糖蛋白(EBOV-GP)特异性血清Ig G抗体水平增长倍数的差异,开展Ad5-EBOV特异性抗原与载体免疫反应研究。首先建立了适用于SPF级动物模型的Ad5载体血清Ig G抗体检测方法。在Ad5的纯化过程中,梯度洗脱时发现病毒峰前有一个单一的蛋白峰,经SDSPAGE、HPLC和Western Blot等方法鉴定,其主在成份为Ad5 Hexon蛋白。通过Source 30Q阴离子柱和Sepharose 4FF分子筛两步柱层析,可获得纯度大于95%的Hexon蛋白。以Ad5-Hexon作为抗原,建立了Ad5结合抗体检测ELISA法。该检测方法与其他亚型腺病毒如Ad4、Ad7具有一定的交叉反应,但对于无关病毒具有良好的特异性;同时该检测方法具有良好的稳定性,板内重复变异系数小于10%,板间和日间重复变异系数小于15%。该检测方法对Ad5载体疫苗免疫小鼠血清的检测结果与Ad5中和抗体检测结果具有良好的相关性。将其应用于Ad5载体疫苗免疫小鼠血清的Ad5结合抗体水平检测,充分显示了该法的快速、简便及高灵敏度和准确度的优势。在Ad5滴鼻预存免疫小鼠模型上评价了Ad5-EBOV特异性抗原与载体的免疫反应。预存免疫小鼠单次肌肉注射免疫接种Ad5-EBOV后,EBOV-GP特异性Ig G抗体反应和Ad5载体Ig G抗体反应相一致,两者均于免疫后2周达到一定的峰值,并能稳定维持6个月以上。进一步探讨了不同加强免疫时间间隔对Ad5-EBOV免疫效果的影响,结果显示不同加强免疫时间间隔Ad5-EBOV诱导产生的EBOV-GP特异性Ig G抗体反应和Ad5载体特异性抗体反应相一致,加强免疫后,两种特异性抗体的增长倍数中位数分别为2.60和2.90。对于EBOV-GP特异性Ig G抗体反应,间隔3个月和6个月进行加强免疫时,其加强免疫后Ig G抗体水平略高于间隔1个月和2个月,但无显著性差异,提示较长的时间间隔可能会获得更高的目的蛋白特异性抗体水平。通过对预存免疫小鼠与无预存免疫小鼠的加强免疫反应进行比较,结果显示无预存免疫小鼠加强免疫的效果显著高于预存免疫小鼠,提示加强免疫前的Ad5载体抗体阻碍了预存免疫小鼠加强免疫效果的提升。鉴于记忆B细胞在疫苗免疫反应中的重要性,以及Ad5载体与EBOV-GP特异性记忆B细胞检测的同质性,B-ELISpot检测结果更能反映Ad5载体与EBOVGP特异性免疫反应的异同。建立了Ad5-Hexon和EBOV-GP特异性B-ELISpot检测方法,确定淋巴细胞的最佳刺激活化时间为4至5天。使用生物素化的Ad5-Hexon和EBOV-GP抗原进行检测,优化了检测方法,使特异性抗原B-ELISpot检测斑点清晰可辨,并提高了检测的特异性,降低了检测的背景信号。对单次肌肉注射免疫Ad5-EOBV免疫后4周内的小鼠进行特异性B-ELISpot检测,结果显示小鼠于免疫后1周即可检测到显著高于对照组的EBOV-GP特异性抗体分泌细胞,该细胞数量于免疫后2至4周内呈现逐渐增加的趋势,同时EBOV-GP特异性抗体分泌细胞数量显著高于Ad5-Hexon。对首次肌肉注射免疫Ad5-EBOV后4周进行加强免疫的小鼠进行特异性B-ELISpot检测,结果显示加强免疫后4周内EBOV-GP特异性记忆B细胞数量有所增加,但与加强免疫前相比无显著性差异。而Ad5-Hexon特异性记忆B细胞数量于加强免疫后1周突然升高,加强免疫后2周下降至略高于加强免疫前水平。虽然单次免疫后4周内EBOV-GP特异性抗体分泌细胞数量显著高于Ad5-Hexon,但两者的血清Ig G抗体水平无显著性差异;同时加强免疫后4周内EBOVGP特异性抗体分泌细胞数量与Ad5-Hexon无显著性差异,但Ad5-Hexon特异性血清Ig G抗体水平却显著高于EBOV-GP。这一结果说明了由于不同抗原特异性抗体ELISA检测方法的灵敏性不同,其检测结果往往不能直接用于比较。同时也从侧面上说明了B-ELISpot检测方法在比较Ad5-EBOV特异性抗原与载体免疫反应差异研究中的重要性。下一步工作重点将放在Ad5-EBOV临床试验受试者外周血淋巴细胞的记忆B细胞检测上,相比于小鼠模型,临床试验受试者细胞的检测结果将更能反应真实的Ad5-EBOV特异性抗原与载体免疫反应情况。