CD48是分子量为40-45kD的GPI锚定糖蛋白,与CD2、CD58、CD244 (2B4)、Ly9和SLAM均属于CD2家族成员。CD48广泛表达于T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性细胞等一系列免疫细胞、内皮细胞以及肿瘤细胞表面,在肿瘤患者血浆中发现可溶性CD48增加。CD48分子参与维持NK细胞平衡和功能效应、在T细胞活化早期产生IL-2并维持T细胞进一步活化过程中起到关键作用,在针对病毒感染治疗中,CD48/CD244是独立于PD-1通路的新型干预靶点。通过CD48、CD244和CD150分子的联合分析可对小鼠HSC的原始性予以精确界定。因此CD48是参与免疫细胞的发育、机体免疫应答和免疫调控的重要分子,在肿瘤免疫和自身免疫过程中起着极为重要的作用,CD48及其信号途径是肿瘤免疫和自身免疫调控的重要靶点。鉴此,本研究克隆了人CD48基因读码框(ORF)全长序列、构建了逆转录病毒表达载体、建立了稳定表达人CD48分子的基因转染细胞株,并研制了鼠抗人CD48单克隆抗体,为进一步探讨CD48分子的作用机理和靶向CD48分子的免疫干预奠定了基础。第一部分人CD48基因转染细胞株的建立研究目的:建立稳定表达人CD48分子的基因转染细胞株。研究方法:提取健康人外周血单个核细胞总RNA,通过RT-PCR克隆CD48基因的ORF全长序列,重组入逆转录病毒载体pEGZ/term,将重组载体命名为pEGZ/CD48。将pEGZ/CD48及其辅助病毒载体pHIT456和pHIT60混合后,采用脂质体法转染包装细胞:293T细胞,获得具有感染能力的重组逆转录病毒的培养上清,而后感染L929细胞,通过Zeocine加压筛选、流式细胞术检测和RT-PCR验证,获得稳定表达CD48分子的基因转染细胞株。结果:1)成功构建重组逆转录病毒表达载体pEGZ/CD48经RT-PCR扩增获得CD48基因ORF全长片段;经酶切鉴定和双向DNA测序表明:获得正确的人CD48基因并成功地重组入pEGZ-term表达载体,命名为pEGZ/CD48。2)成功建立稳定表达人用脂质体法导入293T细胞48h后,通过荧光显微镜可观察到293T细胞表达绿荧光蛋白(GFP),收集培养上清感染L929细胞,两周后获得Zeocine抗性的L929细胞克隆。荧光显微镜下可见Zeocine抗性L929细胞表达绿荧光蛋白。Zeocine抗性L929细胞经免疫荧光标记和流式细胞仪检测并经RT-PCR证实表达CD48分子,命名为L/CD48。结论:在获得正确人CD48基因基础上,成功构建重组逆转录病毒表达载体pEGZ/CD48和稳定表达人CD48分子的基因转染细胞株。第二部分鼠抗人CD48单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究研究目的:为探讨CD48分子生物学功能及其作用机理,并为靶向CD48分子的应用提供研究工具。研究方法:以单核细胞性白血病细胞株THP-1多次免疫Balb/c小鼠,采用B淋巴瘤杂交瘤技术将免疫后小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合,采用L/CD48基因转染细胞株为抗原筛选获得分泌特异性识别人CD48分子的单抗的杂交瘤细胞株3H6,采用试纸法鉴定单抗3H6的类型,流式细胞术分析单抗3H6的识别谱,竞争法分析单抗3H6的识别位点,腹水法生产以及亲和层析分离纯化单抗3H6,将不同剂量的单抗3H6加入CD48+白血病细胞株Raji和THP-1培养体系中,观察细胞生长状态并采用细胞计数法分析细胞增殖情况。结果:成功地建立了稳定分泌抗人CD48单克隆抗体的杂交瘤细胞株3H6,单抗3H6重链为IgG1、轻链为κ链,与商品化抗人CD48单抗MEM-102识别谱一致,通过位点竞争实验表明单抗3H6与MEM-102识别位点不同,进而发现,单抗3H6在体外可促进CD48+细胞株THP-1和Raji细胞聚团并抑制其增殖。结论:成功地建立了稳定分泌抗人CD48单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为研究CD48的生物学功能提供了有力的研究工具。