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公猪在养猪生产中的重要作用主要体现于其精液品质对母猪妊娠率、产仔数及其后代仔猪生产性能等方面的重要影响,而睾丸组织作为公猪的重要生殖器官,其正常的生长发育为保证精子生成过程有序进行具有重要作用。近年来,研究表明非编码RNA在雄性动物睾丸组织中广泛表达且对精子生成具有重要的调控作用,但目前鉴定出的猪睾丸组织发育或精子生成相关非编码RNA数量较少,且作用机理尚不明确。本论文基于课题组前期研究基础,采用RNA-seq技术对不同发育阶段的猪睾丸组织进行cDNA测序和小RNA测序,以鉴定lncRNA、circRNA和miRNA等非编码RNA,并在细胞水平研究其生物学功能,主要研究结果如下:(1)本研究以沙子岭猪睾丸组织为研究对象,分为60日龄、90日龄、120日龄和150日龄4个试验组,每组3个生物学重复,以提取的睾丸组织总RNA为模板构建了12个cDNA文库,采用Illumina Hiseq 4000测序平台进行测序,共计获得164.26 Gb Clean reads,拼接出207,110条转录本。通过一系列生物信息学分析,共计鉴定出25,491条蛋白编码转录本、5,032条猪已知的lncRNA、10,496条新预测的lncRNA、7,232条TUCP和5,380个circRNA,筛选出773个差异表达的lncRNA,其靶基因显著富集于64条GO项。采用实时荧光定量PCR技术验证了9个差异表达lncRNA的表达水平和6个lncRNA在猪睾丸组织中的发育表达谱。采用PCR技术验证了8个circRNA序列剪切位点。(2)本研究以沙子岭猪睾丸组织为研究对象,分为60日龄、90日龄、120日龄和150日龄4个试验组,将提取于3个生物学重复的总RNA等量混合后构建了4个小RNA文库,采用Illumina Hiseq 2500测序平台进行测序,共计获得53,309,184条Clean reads,利用生物信息学方法分析,共计鉴定出293个猪已知的mi RNA和36个新mi RNA,筛选出86个差异表达的miRNA。结合本课题组前期的miRNA和mRNA数据进行关联分析以预测miRNA的靶基因,功能分析显示它们显著富集于81条GO项。采用实时荧光定量PCR技术验证了12个差异表达mi RNA的表达水平和4个miRNA在猪睾丸组织中的发育表达谱。(3)为明确miR-10b对猪未成熟支持细胞生长发育的作用机理,综合应用流式细胞术检测细胞周期、CCK-8和EdU试剂盒检测细胞增殖情况、Annexin V-FITC/PI方法和实时荧光定量PCR技术检测细胞凋亡情况及凋亡相关基因的表达水平。结果表明,过表达miR-10b或抑制表达DAZAP1基因后,S期的细胞比例显著减少(P<0.05),G2期细胞比例显著增加(P<0.05),且细胞增殖活性显著增加(P<0.05),而细胞凋亡率未见显著性变化(P>0.05);随后,通过共转染试验进一步确定miR-10b靶向调控DAZAP1基因促进猪未成熟支持细胞增殖。(4)为明确miR-362对猪未成熟支持细胞生长发育的作用机理,过表达miR-362于猪未成熟支持细胞,流式细胞周期检测结果表明G1期细胞比例显著增加(P<0.05),S期细胞比例显著减少(P<0.05);CCK-8和EdU检测结果表明细胞增殖活性显著降低(P<0.05);Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡结果表明细胞凋亡率显著增加(P<0.05),细胞ATP水平显著降低(P<0.05),细胞凋亡相关基因BCL2表达水平显著降低(P<0.05),BAX和Caspase-3基因表达水平显著增加(P<0.05)。抑制表达RMI1基因于猪未成熟支持细胞后,对细胞增殖和凋亡的影响与过表达mi R-362一致。双荧光素酶报告基因系统实验结果表明mi R-362靶向RMI1基因3′-UTR序列,实时荧光定量PCR检测结果表明miR-362调控RMI1基因的表达。结果表明,miR-362靶向RMI1基因抑制猪未成熟支持细胞增殖而促进其凋亡。综上所述,本研究对猪睾丸组织发育过程中的lncRNA、circRNA和miRNA进行了鉴定、验证和功能注释,并在细胞水平明确了miR-10b和mi R-362调控猪未成熟支持细胞生长发育的机理。为进一步揭示非编码RNA调控猪精子生成的机理提供理论依据,进而为全面揭示猪精子生成的分子机制提供新的启示。